科研 | 通过18F - FDG PET/CT和蛋白质组学分析苯巴比妥成瘾大鼠脑内与胰岛素信号通路相关的葡萄糖摄取和蛋白表达改变
编译：Y.too，编辑：Tracy、江舜尧。
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药物成瘾是一种慢性复发性脑疾病。在药物成瘾者的大脑中人们发现了葡萄糖摄取和代谢的改变。胰岛素介导脑糖代谢，其异常可引起脑损伤和认知功能障碍。在本篇文章中，我们建立了一个90天剂量递增的苯巴比妥成瘾大鼠模型，并评估成瘾相关症状。在苯巴比妥或0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na) (vehicle)给药的第60天和第90天，我们还进行了18F氟脱氧葡萄糖(FDG)正电子发射断层扫描/计算机断层扫描(PET / CT)来检测大脑中的葡萄糖摄取，并通过液相色谱-串联质谱联用技术(LC−MS/MS)进行蛋白质组学研究，进一步通过生物信息学对脑组织中差异表达(DE)蛋白的功能进行分析。结果表明，苯巴比妥成瘾大鼠戒断后出现严重戒断症状，脑内葡萄糖摄取明显增加；蛋白质组学分析显示，苯巴比妥给药后出现大量DE蛋白富集，其中与胰岛素信号通路相关的CALM1、ARAF和Cbl蛋白在第60天显著下调，但第90天未出现明显下调，然而，SLC27A3和NFκB1蛋白(与胰岛素抵抗相关)在第90天显著上调(数据可通过标识码为PXD021101的ProteomeXchange获得)。我们的数据表明，胰岛素信号通路和胰岛素抵抗可能在苯巴比妥成瘾和脑损伤的发生发展中发挥作用，因此该发现可能具有重要的临床意义。
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实验设计
1. 采用苯巴比妥的剂量从每天20连续增加到140 mg/kg/天建立苯巴比妥成瘾的大鼠模型并评估苯巴比妥对服用90天后戒断症状和体重变化的影响；
2. 采用18F-FDG PET/CT分析苯巴比妥治疗后大鼠全脑葡萄糖摄取及成瘾相关脑核；
3. 运用TMT标记定量蛋白质组学分析苯巴比妥治疗的大鼠脑组织；
4. 采用KEGG功能注释分析苯巴比妥处理大鼠后的DE蛋白。
实验结果
1. 停用苯巴比妥后戒断症状及体重变化
首先，我们建立了苯巴比妥成瘾的大鼠模型，方法是将苯巴比妥的剂量从每天20连续增加到140 mg/kg/天，连续90天，并评估苯巴比妥对服用90天后戒断症状和体重变化的影响，数据列于表1和2。用苯巴比妥治疗的大鼠在治疗90天后出现强烈的震颤，阵挛性抽搐，强直性抽搐甚至死亡的明显戒断症状，从24小时到56小时症状显著，最严重的症状出现在48-56小时，但从64小时到观察终点144小时逐渐减轻。苯巴比妥治疗的大鼠和对照组大鼠之间，戒断症状的得分显示出统计学上的显着差异(p<0.05) (表1)，另外，苯巴比妥治疗的大鼠在治疗后的第1天到第8天与体重治疗的大鼠相比体重降低，从第2天到第7天，两组大鼠之间存在统计学上的显着差异(p<0.05) (表2)。
表1 用0.5% CMC-Na(对照)或苯巴比妥处理的大鼠戒断评分
表2 用0.5% CMC-Na(对照)或苯巴比妥治疗90 d后的大鼠体重变化(%)
2. 18F-FDG PET/CT分析苯巴比妥治疗后大鼠全脑葡萄糖摄取及成瘾相关脑核
接下来，我们在第60天和第90天对使用苯巴比妥或0.5% CMC-Na(对照)处理的大鼠进行18F-FDG PET/CT扫描，检测其大脑葡萄糖摄取情况，并从衰减校正后的图像中对数据进行半定量分析(图1)。结果表明，小鼠葡萄糖摄取率(% ID/g)显著高于对照组(p<0.05)；在第60和90天，苯巴比妥处理的大鼠全脑和成瘾相关的脑核(BLA、CA1-3、NAc、PFC和VTA)明显高于0.5% CMC-Na(对照)处理的大鼠。此外，在用0.5% CMC-Na处理的对照大鼠中，从第60天到第90天，整个大脑和成瘾相关脑核的葡萄糖摄取相对稳定，然而，与苯巴比妥治疗后第60天相比，第90天的苯巴比妥治疗后大鼠全脑葡萄糖摄取略高，差异无统计学意义(p>0.05)；但苯巴比妥治疗后第90天，成瘾相关的脑核明显高于第60天(p<0.05) (表3)。
图1 通过18F-FDG PET/CT成像，苯巴比妥或0.5% CMC-Na(对照)处理的大鼠全脑葡萄糖摄取和成瘾相关的脑核
A1、A2和A3：3只大鼠分别用0.5% CMC-Na处理(对照) 60天；B1、B2、B3：苯巴比妥治疗60天的3只大鼠；C1、C2和C3: 3只大鼠分别用0.5% CMC-Na处理(对照)90天；D1, D2, D3: 苯巴比妥治疗60天的3只大鼠。
表3 苯巴比妥对用0.5% CMC-Na(对照)或苯巴比妥经[18F]FDG/PET/CT显像处理的大鼠脑葡萄糖摄取(% ID/g)的影响
3. 基于TMT的苯巴比妥治疗大鼠脑组织的蛋白质组学分析
我们还使用了TMT技术，在第60和90天使用苯巴比妥或0.5% CMC-Na(对照)处理的大鼠的脑组织进行了蛋白质组学分析，数据见表S1和表S2。DE定义为变化倍数(FC) 1.2，表示蛋白表达上调，FC 0.8，表示蛋白表达下调。结果显示，第60天DE蛋白富集381个，其中196个下调，185个上调；第90天DE蛋白富集395个，141个下调，254个上调。
4. 苯巴比妥处理大鼠的DE蛋白分析及KEGG功能注释
此外，我们分析了在第60天和第90天苯巴比妥处理的大鼠中KEGG的DE蛋白和功能注释，并与对照组大鼠进行了对照。结果表明，第60天，与对照组相比，苯巴比妥处理中胰岛素信号通路相关而非胰岛素抵抗相关的蛋白表达显著下调(FC<0.8)，如钙调素1 (CALM1)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶A-Raf (ARAF)和Cbl原癌基因(Cbl)(表4和图2A)，然而，在第90天，与对照组相比，苯巴比妥处理的大鼠胰岛素信号通路相关蛋白的表达没有明显改变。在第90天，与对照组大鼠相比，苯巴比妥治疗大鼠中可溶性载体家族27脂肪酸转运蛋白3型脂肪酸转运蛋白(SLC27A3)和核因子NF-kappa- b p105亚基(NF-κB1)表达显著上调(FC>1.2)。这两种蛋白的上调与胰岛素抵抗有关(图2C)。
图2 参与信号转导途径的蛋白质方案
(A)胰高血糖素信号传导途径。(B)胰岛素信号传导途径。(C)胰岛素抵抗信号传导途径。红色椭圆形，差异表达蛋白；→，兴奋；----，间接作用或关系；抑制；+ P，磷酸化；P，去磷酸化；和O，其他分子。
表4 苯巴比妥对大鼠脑组织DE蛋白的影响
讨论
本研究首先成功建立了苯巴比妥成瘾大鼠模型，并评价了苯巴比妥对戒断症状和体重变化的影响。结果表明，苯巴比妥治疗的大鼠在给药90天后出现明显的戒断症状，包括强烈震颤、抽搐和死亡。成瘾大鼠的戒断症状在24 ~ 56 h显著加重，在64 ~ 144 h逐渐减轻，成瘾大鼠的戒断症状评分与对照组比较差异有统计学意义(p<0.05) (表1)，此外，在治疗后的第2 - 7天，苯巴比妥处理的大鼠体重显著低于0.5% CMCNa(对照)处理的大鼠(p<0.05) (表2)。我们的发现与Chen et al.的报道一致，即苯巴比妥治疗的大鼠早在第60天就表现出身体依赖。
大量研究表明，脑内葡萄糖代谢的改变在药物成瘾者中起着重要作用，18F-FDG PET/CT成像是检测人类药物成瘾者脑内葡萄糖摄取和代谢的理想方法。因此，我们还通过18F-FDG PET/CT成像检测了苯巴比妥成瘾大鼠与对照组正常大鼠的大脑葡萄糖摄取。结果显示，与正常大鼠相比，在第60天和第90天，苯巴比妥成瘾大鼠的全脑和成瘾相关的脑核(BLA、CA1-3、NAc、PFC和VTA)葡萄糖摄取显著升高(p<0.05) (图2和表3)，此外，虽然正常大鼠在第60天至第90天的全脑和脑核中葡萄糖摄取相对稳定，但苯巴比妥成瘾大鼠在第90天的脑核中葡萄糖摄取明显高于第60天(p<0.05) (表3)，这一结果与之前关于可卡因和鸦片成瘾者的大脑核内葡萄糖摄取增加的研究一致。我们和其他组的数据表明，18F-FDG PET/CT是检测脑葡萄糖摄取和代谢的有效方法。
我们用LC-MS/MS分析苯巴比妥或对照溶液治疗第60和90天大鼠脑组织中与胰岛素信号通路或胰岛素抵抗相关的DE蛋白，结果显示，在第60天，与对照组相比，苯巴比妥处理的大鼠的CALM1、ARAF和Cbl(与胰岛素信号通路相关)均显著下调(FC<0.8) (图2B)。已有研究表明，CALM1参与调控与药物成瘾密切相关的多条信号通路，在学习记忆中发挥着重要作用。CALM1通过抑制糖原合成，促进糖原分解，调节胰高血糖素和胰岛素信号通路(图2A,B)，当CALM1下降时，大脑中的糖原合成增加，糖原分解减少，因此，脑细胞需要摄取更多的葡萄糖来满足脑内糖原合成和能量代谢的需要，我们的研究结果证实了这一点(图1和表3)。ARAF促进细胞的蛋白质合成、增殖和分化，药物成瘾可下调ARAF，抑制蛋白质合成、细胞增殖和分化，进而诱发衰老和脑损伤。如图2B所示，Cbl可以调节细胞膜上葡萄糖转运体4 (GLUT4)的表达，促进葡萄糖转运进入细胞，GLUT4的表达相对较低，主要位于海马和杏仁核，维持海马依赖的认知功能，而Cbl表达下调可能导致海马和杏仁核葡萄糖摄取减少。
有趣的是，在第90天，我们发现苯巴比妥治疗的大鼠中与胰岛素信号通路相关的DE蛋白没有显著变化。但我们确实发现，与对照组相比，苯巴比妥处理大鼠的SLC27A3和NF-κB1(与胰岛素抵抗相关) (FC>1.2)蛋白表达显著上调(表4和图2C)。SLC27A3的主要作用是脂肪动员，其上调可促进脂质代谢；NF-κB1可抑制胰岛素受体底物(IRS)的生理生化过程，从而影响PI3K-Akt信号通路。PI3K-Akt通路主要参与细胞周期调控，与葡萄糖代谢和蛋白质合成密切相关，NF-κB1上调可明显抑制PI3K-Akt信号通路，进而诱导胰岛素抵抗，进一步降低葡萄糖代谢效率。大量研究表明，PI3K-Akt信号通路紊乱是胰岛素抵抗的主要致病机制之一，NF-κB可诱导成瘾性过程相关基因的表达。另外有研究表明，大脑中的胰岛素抵抗与脑损伤密切相关，因此，我们的结果证实了胰岛素抵抗与苯巴比妥成瘾大鼠的脑损伤有关，然而，大脑的调控机制非常复杂，其他可能的机制还需要进一步研究。
结论
我们成功地建立了苯巴比妥成瘾大鼠模型。成瘾大鼠出现明显的戒断症状，如强烈震颤、抽搐，甚至在戒断后死亡。18F-FDG PET/ CT分析显示，在第60和90天，苯巴比妥成瘾大鼠全脑及成瘾相关脑核葡萄糖摄取显著高于对照组(p<0.05)。对添加苯巴比妥后大鼠脑组织的蛋白质组学分析显示，在第60天，有381个DE蛋白富集，196个蛋白下调，185个蛋白上调；在第90天，有395个DE蛋白富集，141个蛋白下调，254个蛋白上调。与胰岛素信号通路相关的CALM1、ARAF和Cbl均显著下调(FC <0.8)，但在第90天，与对照组相比，苯巴比妥成瘾大鼠没有明显变化，成瘾大鼠胰岛素抵抗相关基因SLC27A3和NF-κB1的表达(FC>1.2)在第90天明显高于正常大鼠。我们的数据表明，胰岛素信号通路和胰岛素抵抗可能在成瘾的发展过程中发挥作用，并可能是与成瘾脑损伤相关的机制。因此，我们的研究可能具有重要的临床意义