科研| 土壤中的CdS纳米颗粒诱导蚕豆根和叶的代谢重编程（国人佳作）
编译：王艳林，编辑：谢衣、江舜尧。
原创微文，欢迎转发转载。
纳米技术的快速发展引起了人们对纳米颗粒（NPs）的环境毒性的关注。然而，关于植物中NP毒性的分子机制知之甚少。将蚕豆植物种植在每公斤土壤分别添加0、10和100 mg硫化镉（CdS）-NPs的土壤中培养4周，然后对该植物的对CdS-NPs胁迫的表型，生化和代谢响应进行了评估。代谢组学分析显示，暴露于CdS-NP后，包括N-乙酰基-5-羟色胺，2-羟基丁酸，腐胺和黄酮在内的几种抗氧化代谢物显著上调（1.2至39.2倍），但没有看到负面的表型效应（植物生物量，光合色素含量和脂质过氧化作用）。该观察结果符合通过生物通路分析确定的抗氧化防御相关代谢通路（酪氨酸途径和苯丙烷生物合成）的调控。重要的是，叶片中的代谢产物是根部的两倍，包括三氮相关的（嘌呤代谢；丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢；β-丙氨酸的代谢）和两碳相关的（泛酸和CoA生物合成和碳固定）代谢途径。这些结果表明，为了减轻土壤中CdS-NP暴露的毒性，植物可以显著地重编程叶而不是根的代谢谱，这可能随后影响产量和作物品质。
论文ID
原名：CdS nanoparticles in soil induce metabolic reprogramming in broad bean (Vicia faba L.) roots and leaves
译名：土壤中的CdS纳米颗粒诱导蚕豆根和叶的代谢重编程
期刊：Environmental Science-Nano
IF：7.683
发表时间：2019年11月
通讯作者：季荣
通讯作者单位：南京大学
实验设计
实验结果
1 蚕豆对Cd的吸收
暴露于CdS-NPs时，会以剂量依赖的方式增加所有蚕豆组织中Cd的含量（p <0.05）（ESI†图S2A），其中根>茎>叶。高剂量（100 mg kg-1）CdS-NP处理中的叶片（1.0 ± 0.1 mg kg-1），茎（2.3 ± 0.4 mg kg-1）和根（35.1 ± 7.0 mg kg-1）中Cd含量分别比对照高27倍，30倍和100倍。由于先前研究中使用的CdSe-NPs不能转移到植物的叶片上，因此，在这项研究中叶片中检测到的Cd大部分来自CdS颗粒中溶解的Cd2+，这可能由根际环境改变，例如pH和根系分泌物，而根中的Cd可以归因于Cd2+和CdS颗粒。先前的研究表明，液体培养基中的CdS-NPs（<10 nm）可以通过内吞作用转移到木本植物根的木质部/韧皮部。100 mg kg-1剂量的CdS-NPs的土壤中的水可吸收Cd浓度显著高于对照土壤（p <0.05）（ESI†表S3）。因为水溶性Cd代表了Cd的易于生物利用的比例，所以Cd的较高生物利用度表明，100 mg Kg-1 CdS-NP处理的蚕豆组织中Cd的积累量更大。
2 蚕豆的光合色素和生物量
ESI†图S4A显示了暴露于不同剂量的CdS-NPs的植物的Chla，Chlb和类胡萝卜素含量。两种剂量的CdS-NP均未改变Chlb水平。在暴露于10 mg Kg-1 CdS-NPs的植物中，Chla和类胡萝卜素的浓度显著增加（p <0.05），而100 mg Kg-1 CdS-NPs处理对这两个参数均无显著影响（ESI†图S4A）。先前的一项研究报道了暴露于80 mg L-1 CdS-NPs的水培培养基中拟南芥中Chl生物合成的完全抑制作用。较低（10 mg kg-1）但不是较高（100 mg kg-1）剂量的CdS-NPs增加植物中Chla和类胡萝卜素含量的机制尚不清楚，但可能涉及兴奋效应；这种现象已在生长在被3.3 mg kg-1的Cd污染的土壤中的小麦植物中得到证实。但是，在本研究中，蚕豆表型不受CdS-NP的影响。纳米颗粒暴露既不会改变组织生物量，也不会改变茎长（ESI†图S3）。
3 脂质过氧化和总酚类化合物
MDA是脂质过氧化作用的副产物。如ESI†图S4B所示，暴露于CdS-NPs不会显著影响叶片和根中的MDA含量，表明在暴露28 d后，两种剂量均未引起脂质过氧化作用。酚类化合物是植物中的非酶类抗氧化剂，在抗氧化防御中发挥关键作用。相对于对照，CdS-NP暴露对植物根部总酚类化合物的含量没有影响（ESI†图S4C）。但是，与10 mg kg-1 CdS-NPs处理相比，100 mg kg-1 CdS-NPs暴露导致叶片总酚含量显著降低（p <0.05），但与对照相比无显著差异。后者可归因于植物对污染物的反应的兴奋效应，这是一种以低剂量刺激为特征的浓度响应现象，已在广泛的分类群（包括微生物，植物和动物）中观察到，即本研究表明，较低剂量的CdS-NPs可以诱导蚕豆叶片中酚类化合物的产生；高剂量诱导的氧化应激可能是由于上述Cd组织含量数据所支持的，是由于从颗粒中释放出的Cd2+，因为在茶叶愈伤组织中还观察到Cd2+浓度为7.0 mg L-1时酚类化合物的含量降低。长期暴露于CdS-NPs将对脂质过氧化和总酚类化合物产生明显影响，因为Cd2+不断从CdS-NPs中溶解出来，这需要进一步研究。
4 蚕豆中的大量和微量营养素
矿物质营养对于植物新陈代谢至关重要。尽管CdS-NPs不会显著影响叶，茎或根组织中的K，Ca，Mg和Fe含量（ESI†表S2），但根和叶中的Zn含量却因暴露于100 mg kg-1 CdS-NPs分别显著增加了12.5％和16.2％（p <0.05）（ESI†图S2B）。Zn和Cd就其在植物中的蓄积而言发挥拮抗作用，并且已经表明植物通过优先吸收Zn来减轻Cd诱导的毒性。这可能解释了蚕豆植物中Zn的积累，特别是考虑到暴露于10和100 mg Kg-1 CdS-NPs的植物土壤中水可吸收的Zn含量显著下降了26.2％和57.8％（ESI†表S3）。此外，Zn还具有稳定和保护生物膜免受氧化和过氧化损伤的作用。实际上，Zn在植物组织中的积累减轻了Cd诱导的胁迫，这也许可以解释为什么植物生物量保持不变（ESI†图S3）而脂质过氧化却没有被诱导（ESI†图S4B），尽管植物组织中的Cd含量增加了（ESI†图S2A）。
5 蚕豆根的代谢组学
基于GC-MS的非目标代谢组学分析鉴定并半定量了蚕豆植物根中的242种代谢物。PLS-DA负荷图显示，两种CdS-NP处理下的植物代谢物与对照的代谢物明显分离（图1），表明CdS-NPs改变了植物根部代谢物谱。PLS-DA模型提供所有代谢物的VIP评分，VIP> 1.5表示最可靠分离的化合物。ESI†图S5A列出了VIP得分> 1.5的31种代谢产物。通过单变量（独立t检验）和随后的多变量分析确定了被CdS-NPs显著改变的根部代谢产物水平（表1）。
两种剂量的CdS-NP都显著影响了许多与清除ROS相关的根代谢物的水平，包括N-乙酰基-5-羟基胺，去甲肾上腺素和2-羟基丁酸。与对照相比，分别暴露于10和100 mg Kg-1 CdS-NPs的蚕豆根中，N-乙酰基-5-羟色胺的水平分别增加了2.7倍和1.5倍（表1）。N-乙酰基-5-羟基色胺是N-乙酰基-5-甲氧色胺的前体，N-乙酰基-5-甲氧色胺直接清除各种胁迫条件下产生的ROS。因此，N-乙酰基-5-羟色胺的上调表明CdS-NPs引发了蚕豆根中ROS的过量产生。相比之下，10和100 mg Kg-1 CdS-NPs分别使根的去甲肾上腺素含量显著降低50％和70％（表1）。多巴胺的下游产物去甲肾上腺素是植物中自由基的清除剂，因此可能导致光合作用的氧气减少。去甲肾上腺素的下调因此可能反映出ROS产生和清除的不平衡。2-羟基丁酸可刺激4-二氨基丁酸（GABA）的产生，GABA是一种强大的抗氧化剂，也可清除ROS。虽然在对照中未检测到2-羟基丁酸，但其在蚕豆根部的含量却显著增加（表1）。总之，N-乙酰基-5-羟基色胺和2-羟基丁酸的上调和去甲肾上腺素的下调似乎是蚕豆抵抗CdS-NP诱导的氧化胁迫的系统防御策略的一部分。抗氧化剂的上调可能是导致根部MDA含量保持不变，以及对生物量的整体缺乏影响。
图1 暴露于两种不同浓度的CdS-NP 28天的蚕豆植物的根（A）和叶（B）中代谢物的偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）的得分图。数据为平均值和标准偏差（n = 4）。
表1 选定的暴露于含有10和100 mg Kg-1 CdS-NP的土壤中植物根系代谢物。数据为平均值和标准偏差（n = 4）。a与对照相比，10和100 mg Kg-1 CdS-NP处理中根部代谢产物的相对丰度。b在两种CdS-NP处理中均出现了新的代谢物。c未检测到。
高剂量CdS-NP暴露也引起许多氨基酸及其衍生物水平的显著变化。例如，O-乙酰丝氨酸，半胱氨酰甘氨酸，L-谷氨酸，N-甲基-L-谷氨酸和谷氨酰胺增加了10–160％，N-乙基甘氨酸，N-甲基色氨酸，甘氨酸脯氨酸和N-甲基-DL-丙氨酸减少了30–100％（表1）。氨基酸不仅是蛋白质的组成部分，而且在许多生理途径中也起着关键作用。因此，氨基酸及其衍生物的上调和下调可能标志着蛋白质生物合成和分解代谢的改变。半胱氨酸甘氨酸是谷胱甘肽（GSH）的降解产物，谷胱甘肽是一种可溶性抗氧化剂，可去除植物中的ROS。因此，暴露植物中这种氨基酸衍生物的增加表明，CdS-NPs诱导了氧化应激，因此导致了GSH的降解。谷氨酸和谷氨酰胺与初级氮代谢有关。它们在高剂量CdS-NPs处理的蚕豆中的上调表明，植物中的初级氮代谢不受颗粒的抑制。除了氨基酸及其衍生物外，在暴露于高剂量CdS-NP的蚕豆根中，含氮化合物尿素，尿嘧啶，马来酰亚胺，己二酰胺和硫辛酰胺也显著增加（表1）。总之，这些结果表明CdS-NPs破坏了暴露植物中的氮代谢。尿素是细菌，藻类，真菌和植物的氮源，并参与豆类固氮。因此，CdS-NPs对固氮的影响值得进一步研究。
CdS-NP暴露也显著改变了参与碳水化合物代谢的代谢物水平。在暴露于100 mg Kg-1 CdS-NPs的植物中（表1），葡萄糖，核糖和苏糖醇水平降低了40–80％，而帕拉金糖醇，景天庚酮糖和松二糖水平显著上调（表1）。糖在信号转导，胁迫防御和能量代谢中起重要作用，而糖醇则是节能化合物。因此，糖水平的下调和糖醇水平的上调表明植物在其胁迫防御反应中使用分析的糖作为能源，导致各个高能化合物的积累。同样，在10和100 mg kg-1 CdS-NPs暴露的植物中，TCA循环的中间产物并为糖类生物合成提供碳骨架的琥珀酸的水平分别显著增加了50％和20％（表1）。总之，CdS暴露影响土壤中种植的蚕豆植物根系中的氮和碳代谢。
6 蚕豆叶片的代谢组学
总计，通过GC-MS在蚕豆叶片中鉴定和半定量了275种代谢物。与根部相似，PLS-DA负荷图显示两种CdS-NP处理均沿PC1与对照明显分离，这解释了总方差的14.7％（图1）。有趣的是，该结果表明，尽管叶片未直接暴露于CdS-NPs，但颗粒显著改变了蚕豆叶片的代谢产物。ESI†表S4中列出了87种变化显著的代谢物，ESI†图S5B中显示了VIP得分> 1.5的28种代谢物。黄酮，腐胺和去甲肾上腺素是与ROS去除和抗氧化防御相关的三种代谢产物，它们的水平在两种剂量的CdS-NPs的作用下均显著增加（图2）。将植物暴露于10和100 mg Kg-1 CdS-NPs后，具有高ROS清除能力的类黄酮黄酮水平分别增加13倍和39倍（图2）。类黄酮在植物生态系统中扮演不同的角色，包括作为胁迫保护剂和信号分子。此外，与对照相比，暴露于高剂量CdS-NPs的叶片中常见的多胺腐胺水平增加了30％（p> 0.05）（图2）。腐胺通过诱导金属螯合清除ROS，激活抗氧化剂并保护生物膜和生物分子。叶片中去甲肾上腺素水平也显著增加（ESI†表S4）。如上所述，去甲肾上腺素除了参与许多细胞过程外还表现出抗氧化活性。两者合计，蚕豆叶片中三种抗氧化剂的上调表明植物主动解毒以达到氧化平衡，从而减轻了CdS-NPs诱导的氧化胁迫。这种高水平的响应说明暴露的植物叶片中没有氧化损伤和表型变化。
与根相似，在叶片中也观察到氨基酸及其衍生物的显著变化。与对照组相比，100 mg Kg-1 CdS-NPs处理的丙氨酸，谷氨酸，正亮氨酸，环亮氨酸，鸟氨酸和氧化脯氨酸的含量显著增加（p <0.05）（图2）。先前报道了通过液相色谱-质谱联用测定，暴露于CdS-NPs（尺寸<10 nm）的大豆叶片中氨基酸含量增加。氨基酸谷氨酸参与氨同化作用，在高剂量CdS-NP暴露下其含量增加了1.8倍（图2）。在高剂量CdS-NP暴露下，根瘤和非根瘤植物中的主要含氮化合物鸟氨酸的含量增加了6.6倍（图2）。尿囊酸是根瘤植物可溶性氮库的一个组成部分，在高剂量CdS-NP暴露下其含量增加了4.2倍（图2）。这些数据表明CdS-NPs对植物氮代谢有积极影响，尽管机理尚不清楚，但增加的储藏蛋白合成可能为这些颗粒解毒提供了一种手段。
高剂量的CdS-NPs也显著增加了蚕豆叶片中2，4-二氨基丁酸和3-氨基丁酸的含量（图2）。这两种化合物是非蛋白质氨基酸GABA的衍生物。此外，在暴露于CdS-NPs的叶片中，GABA降解产物（4-羟基丁酸）和GABA前体（腐胺）的水平均显著增加（p <0.05）（图2）。先前已证明这四种GABA相关化合物的上调是植物对生物和非生物胁迫的响应的一部分。响应100 mg Kg-1 CdS-NPs，叶片中的半胱氨酸甘氨酸（ESI†表S4）增加了12％，与根部的结果非常相似（表1）。如上所述，半胱氨酰甘氨酸是抗氧化剂GSH的降解产物。因此，它的上调表明CdS-NPs激活了GSH以去除蚕豆植物根和叶中过量的ROS。
氮和碳代谢通过TCA循环联系在一起。高剂量CdS-NPs上调了叶片中的几种TCA循环中间体，包括异柠檬酸，延胡索酸，衣康酸和马来酸（图2），表明暴露植物中TCA循环的激活增强。
烟酸是参与氧化还原稳态和胁迫信号传导的植物途径的关键成分。暴露于100 mg Kg-1 CdS-NPs的蚕豆植物中烟酸的上调（图2）表明叶片对颗粒诱导的氧化胁迫的防御反应。暴露植物叶片中抗氧化剂4-羟基苯甲酸的显著增加支持了这一结论（图2）。
图2 暴露于含10和100 mg Kg-1 CdS-NPs的土壤中28天的蚕豆植物叶片中代谢产物丰度的相对变化。结果表示为与对照处理相比的倍数变化。数据为平均值和标准偏差（n = 4）。
7 蚕豆的途径破坏
使用在线工具MetaboAnalyst 4.0进行了途径富集分析。结果显示在图3中。在根部，暴露于较高剂量的CdS-NPs的植物中，乙醛酸/二羧酸代谢和酪氨酸代谢这两个生物学途径发生了显着变化（p <0.05）（图3A）。这一发现与上述处理过的植物的根中碳和氮代谢的破坏相一致（总结在图4A中）。
在叶片中，途径分析表明六个代谢途径被显著破坏（p <0.05）（图3B）：苯丙烷生物合成；泛酸和CoA生物合成；嘌呤代谢；丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢；β-丙氨酸代谢；和碳固定。考虑到叶片没有直接暴露于CdS-NPs，叶片中受干扰的代谢途径数量多于根部，这是出乎意料的。因此，在毒性评估中，低分子量代谢物似乎是比表型参数更敏感的终点指标。在这六个生物途径中，苯丙氨酸途径参与所有植物对生物和非生物胁迫的反应以及植物防御系统的激活，在这项研究中，包括在暴露于CdS-NP胁迫的叶片中多种抗氧化代谢产物的产生（图4B）。还激活了与氮代谢有关的三个途径（嘌呤代谢，丙氨酸，天冬氨酸，谷氨酸代谢和β-丙氨酸代谢）和与碳代谢有关的两个途径（泛酸和CoA生物合成及碳固定）。两者合计，分析表明，CdS-NPs，特别是在较高剂量下，能显着激活蚕豆植物的抗氧化防御系统，并且还影响其叶片中的碳和氮代谢，这比CdS-NP诱导的胁迫对根的敏感性要高得多。
图3 使用MetaboAnalyst 4.0对暴露于含有100 mg Kg-1 CdS-NP土壤的蚕豆根（A）和叶（B）进行途径分析。在途径分析中考虑所有检测到的代谢物。根中改变的途径（A）：乙醛酸和二羧酸代谢（1）和酪氨酸代谢（2）。叶片中改变的途径（B）：苯丙烷生物合成（1），泛酸和CoA生物合成（2），嘌呤代谢（3），丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢（4），β-丙氨酸代谢（5）和碳固定（6）。
图4 在暴露于含有100 mg Kg-1 CdS-NP的土壤中的蚕豆植物的根（A）和叶（B）中提出的代谢变化。橙色和绿色阴影分别代表上调和下调的代谢物。
8 环境影响
虽然在暴露的28 d内，土壤中的CdS-NPs对蚕豆植物的表型参数（光合色素含量，生物量和脂质过氧化作用）均没有明显影响，代谢组学揭示了植物根和叶的代谢物谱上明显的和统计学上显著的变化。重新编程的抗氧化剂代谢产物的产生大概反映了植物对CdS-NP胁迫的分子防御反应。叶中黄酮，腐胺和去甲肾上腺素的敏感反应表明，在豆类植物中使用这些化合物作为土壤中CdS-NPs诱导的氧化应激的生物标记。因此，代谢组学可能是早期检测Cd污染土壤的合适方法。
在植物中，碳和氮代谢（包括糖，有机酸，氨基酸和含氮化合物）的重新编程减轻了CdS-NPs的毒性，这可能是由游离的Cd2+或颗粒特异性响应引起的。重要的是，这种反应可能会对长期暴露于CdS-NPs的植物的作物产量和品质产生不利影响。