科研 | Cancer Cell：人脑胶质母细胞瘤的蛋白质基因组学和代谢组学特征
编译：微科盟霸道肿柴，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。
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论文ID
实验设计
实验结果
1．利用蛋白质基因组学和代谢组学特征描述胶质母细胞瘤的分子亚型
作者首先对99个GBM和10个基因型-组织表达（Genotype-TissueExpression, GTEx）正常大脑样本的蛋白质基因组图谱进行了表征，分析结果显示这些样本具有不同的起源和成人GBM的典型临床特征。其中，6例携带IDH1(R132H)突变（中位数47岁），发病均早于IDH1(Wild-Type)（中位数59岁）。此外研究者还检测到另外一个非热点突变IDH1(R222C)。
研究者首先将所有样品均质并均分，之后后用于十种不同的组学分析（结果见图1A）。通过质谱（MS）定量检测磷酸化和乙酰化，作者发现了许多蛋白的结构变异（Structure variants, SV），其中就包括EGFR、PDGFRA，以及抑制肿瘤的PTEN和NF1。WES和WGS分析发现，TERT基因的启动子（TERTp）的变异等位基因频率（Variant allele frequency, VAF）> 5 %（图1 B）。图S2A展示了常见的focal和arm-level两种拷贝数变异的分析结果（CNVs）。
作者还研究了蛋白丰度和磷酸化水平（图1 C, S2B-S2F; STAR methods），虽然结果和此前基于TCGA表达的分型研究一致，但在本研究中有29 %的样本（27个肿瘤样本）被划分到了不同的亚型（图1 C和S2B）。因此，作者将在IDH-WT GBM中观测到的三种亚型分别命名为①nmf1（原神经型，n = 29）、②nmf2（间叶型，n = 37）以及③nmf3（经典型，n = 26）。RNA、蛋白质和磷酸化水平的通路富集分析表明：
①nmf1富集了突触小泡循环、神经传递等通路，此外参与TCA循环和氨基酸代谢的蛋白具有更高的乙酰化水平；
②nmf2富集了天然免疫应答过程，包括中性粒细胞脱颗粒、吞噬和细胞外基质组织，以及天然免疫系统激活、过氧化物酶体蛋白摄入和糖酵解等通路；
③nmf3则富集了mRNA剪接和RNA代谢，以及染色质修饰物和DNA修复蛋白的乙酰化等通路。
与这三种亚型相关的临床数据显示，与非混合亚型（n = 12）相比，具有两种或更多亚型的混合型肿瘤预后较差（IDH1突变型肿瘤除外，Figure S2B and C）。除此之外，研究者还发现了三种与低生存率相关的蛋白：HIST3H2BB的低表达，以及MT-CYB和PRODH的高表达。
并且，通过全基因组DNA甲基化分析，作者鉴定出了六种DNA甲基化亚型，其中包括两种不同的胶质瘤CpG岛甲基化表型（G-CIMP），分别是dm2和dm6亚型，前者为IDH-WT型，其胞内的转录和mRNA剪接通路发生了上调；后者为IDH-突变型，相应的是染色质组织通路的上调。对两种亚型的分析结果还表现出从头甲基化酶（de novo DNA methylases）水平的上升（图S2E）。作者还利用ProFun方法检测了DNA甲基化与RNA或蛋白质丰度的顺式作用关系。例如，在90例肿瘤样本中发现有38个样本MGMT基因（O~6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶，译者注）的启动子区域发生了高水平的甲基化，同时该基因的RNA和蛋白水平均有所降低(Welch’s t test p = 4.9e-11 and 2.6e-6, respectively) (Figure S2G; Table S2) 。
图1 蛋白基因组学结果汇总
（A）本研究中10种数据类型的汇总；（B）在至少5 %样本中发现的差异基因；（C）基于CNVs、表达量、蛋白水平和磷酸化丰度的多组学NMF聚类分析，热图显示的是亚型之间的差异表达，包括DNA甲基化、乙酰化、代谢组和脂质组。通路的富集分析显示了nmf1、nmf2、nmf3亚型之间与神经元活动相关的通路、免疫反应通路、细胞周期通路的差异。
2．驱动基因改变对致癌蛋白丰度和磷酸化水平的影响
在第二部分中，作者将基因改变（突变、CNVs、融合和SVS）与RNA、蛋白质表达和磷酸化水平联系起来，观察到95个顺式-反式磷酸化事件（图2 A和B），结果发现EGFR和PDGFRA的顺式作用较强，其RNA和蛋白质表达显著上调，并且在S1166和S1067/S1070等位点的磷酸化水平也显著增加。在反式磷酸化水平上，EGFR突变型肿瘤中的CTNNB1（β- catenin），尽管mRNA水平降低，但其蛋白水平却有所升高，并且PTPN11的Y62位点和PLCG1的Y783位点的磷酸化也增加（图2A和2B）。这些观察结果说明蛋白质定量检测对于研究通路的激活具有重要意义。
肿瘤抑制基因RB1、NF1、PTEN和ATRX在基因突变和各自基因产物的RNA、蛋白质和磷酸化水平降低之间显示出良好的相关性。TP53的突变对蛋白质稳定性的增加具有普遍影响，本研究确定了与增加稳定性相关的特异性磷酸化位点。其中，TP53在S315位点的磷酸化和TP53BP1在S1099、S1106和S1109等位点的磷酸化都与TP53蛋白表达的增加有关（图2A、2B和S3A）。TP53的变异主要是其DNA结合域内的错义突变（图2C），包括一些热点突变和罕见突变。而相比于TP53野生型GBM样本，TP53突变型样本中，TP53蛋白的表达升高，表现在蛋白而非RNA水平。比对RNA-seq的数据，结果发现存在一个反复出现的剪接位点——X126的突变，导致该基因第5个外显子的阅读框缺失5个氨基酸（Figures2C and S3C）。
本研究还评估了已知的磷酸化TP53及其下游靶点的激酶。在TP53变异的GBM样本（图2A、2B和2D）中，ATR、MAPK3、CDK2和CDK9蛋白水平和（或）磷酸化水平升高，而MDM2在RNA和蛋白水平上都有所下降。携带TP53突变的肿瘤样本显示DNA修复相关基因磷酸化水平的上调，但其蛋白水平无显著增加（图2D），表明磷酸化调控具有特异性。
此外本研究还观察到RB1与下游靶基因CDK2、CDK6、MCM2、MCM4和MCM6之间的负反馈调节，而NF1对IRF8也有类似的影响（图2A和2B）。Rb1突变的样本表现出Rb1的显著下调，和MCM2、MCM4以及MCM6的显著上调（图2E）。并且，在NF1突变的样本中，研究者观察到了控制小胶质细胞运动的转录因子IRF8在蛋白和RNA水平的上调（图2A和2B）。
GBM细胞会采用不同的端粒延长机制。WGS数据分析发现，74 %的原发性GBM样本中存在热点突变TERTp （NM_198253.2:c.-124C>T[C228T] 和c.-146C>T [C250T]），结果导致TERT RNA水平的上升（图S3D and S3E）。作者同时还发现，ATRX突变与TERTp突变互斥，但会与TP53和IDH1(R132H)这两种突变共存（图S3F）。其中9种ATRX突变显著降低了该基因的RNA水平（图S3G），免疫组化染色结果证明，在ATRX- WT并且IDH1突变(R132H)的肿瘤样本中，ATRX蛋白的表达的确会缺失（图S3H）。但尽管如此，ATRX的伴侣蛋白的表达量，无论是蛋白水平还是RNA水平，都不受影响。这就引出了一个问题：当ATRX缺失时，这些复合体的功能如何？（图S3I andS3J）
图2 SMGs的顺式和反式作用，以及TP53调节DNA修复基因和RB1对细胞周期基因的影响
（A）显著突变基因（y轴）对RNA和蛋白水平（x轴）的顺式和反式作用，表明这些效应通常是相似的；（B）显著突变基因（y轴）对蛋白质磷酸化状态（x轴）的顺式和反式影响；（C）TP53变异样本与TP53-WT样本中RNA和蛋白表达的比较；（D）在TP53突变体（n=32）和TP53-WT（n=67）样本中，DNA修复基因中差异表达的蛋白和磷酸化蛋白，右图表示的是目前已知的差异表达蛋白和磷酸化水平差异的调控示意图；（E）RB1变异引起的CDK2、CDK6、MCM2、MCM4、MCM6和RB1蛋白表达的改变，右图表示的是RB1-突变（n=10）和RB1-WT（n=89）样本中RB1、MCM2、MCM4和MCM6之间的相互作用示意图。
3．RTK信号级联在GBM中被激活
与逆转录病毒相关的基因组位点，如EGFR、PDGFRA和MET，其拷贝数在GBM中经常会增加。本研究鉴定了45个EGFR结构突变（SV）肿瘤，结果显示所有肿瘤都有出现了该基因拷贝数的增加，即EGFR扩增，表明SV和CNV高度相关（图3A）。并且，所有EGFR变异的肿瘤样本中，EGFR都具有较高的RNA和蛋白水平，以及较高的Y1172位点磷酸化水平，表明EGFR通路被激活了。
在EGFR变异的GBM样本中，研究者还观测到了较高水平的EGFR自磷酸化，并伴随着PHLDA1、PHLDA3、转录因子SOX9、细胞粘附蛋白CTNND2，以及细胞周期相关蛋白CDK6和CDKN2C丰度与磷酸化水平的增加（图3B和3C）。PHLDA1和PHLDA3的表达在RNA水平未发生显著变化，这与下游EGFR通路激活后的表型一致。接下来，研究者利用IHC对6个样本中的5个肿瘤组织进行了SOX9表达的验证，结果如图S4D所示。
此外作者还观测到，在EGFR变异的样本中，PTPN11-Y62，PLCG1-Y783，RB1-S795Y805，MAP3K1-S1408和EGFR特定位点的磷酸化水平也均有所增加（图3B）。值得注意的是，PTPN11的总蛋白水平无显著变化，这表明其活性主要受磷酸化作用的调节（图3C）。与EGFR-WT相比，EGFR突变亚型的样本中，PLCG1的Y783位点表现出更高的磷酸化水平，同时蛋白水平无显著变化，这可能是EGFR激活PLCG1的增殖，迁移和侵袭作用的一种潜在机制。
研究者对EGFR和PDGFRA进行了激酶底物研究，并发现GAB1在Y689和Y657位点有高水平的磷酸化，这与EGFR的高表达相一致。相应地，PTPN11在Y546和Y584位点的磷酸化也与PDGFRA的高表达相关（图3D）。在GBM中，PTPN11被EGFR或PDGFRA相关的磷酸化激活，表明它可能是一种普遍性的RTK信号枢纽——PTPN11，GAB1和GRB2形成复合物，并由RTK共同调节以激活RAS通路。图2A的结果显示EGFR的激活状态与GAB1蛋白表达的上调和GRB2的下调有关。在本研究中，作者使用IHC证明了EGFR突变的肿瘤中GAB1表达的升高。
4．不同免疫亚型GBM标志物的表达特征和表观遗传学特征
研究者使用xCell的单样本GSEA生成细胞亚型免疫富集得分，发现了四种不同的GBM免疫亚型（图4A），分别命名为im1-4。免疫亚型1（im1）总体得分较高，其特征包括小胶质细胞、巨噬细胞和淋巴细胞水平升高；免疫亚型2和3（im2和im3）中的巨噬细胞和淋巴细胞的比例表现出相反的特征，其中im2亚型中的巨噬细胞水平较高，淋巴细胞水平较低；im3相反，但im3具有较高的神经元评分（图4A）；免疫亚型4（im4）与其他亚型不同，该亚型所有免疫细胞类型的富集度均明显低于其他亚型（被称为“免疫沙漠”，编者注）。此外，间叶亚型GBM中富集了im1和im2两个亚型，而IDH突变在im3亚型中过表达。DNA甲基化dm3亚型与im1亚型密切相关，这和dm3与免疫基因表达的相关性是一致的。作者还利用转录组数据和蛋白质去卷积（图4A）等算法，在基于TCGA的GBM分型中验证了这四种免疫亚型。
除了上述研究之外，作者还对18个GBM样本进行了snRNA-seq（包括7个im1，5个im2，1个im3，5个im4亚型样本；结果见图4A）。该部分的研究结果显示，TAMs是GBM肿瘤微环境中最主要的非肿瘤性细胞群（图4B）。im4亚型中T细胞和TAMs浸润百分率（平均分别为1.3%和6%）均低于其他免疫亚型（平均分别为7%和19%）；im1肿瘤的小胶质细胞和巨噬细胞在体积水平上表现出较高的分数，但在im1-3的snRNA-seq中没有观测到这样的结果，这可能是由于体积数据是来自于TAMs所占的百分比和TAMs本身的基因表达。支持这一可能解释的是，作者观察到im1亚型的TAMs在RNA和蛋白质水平上有相关基因的上调（图4C）。在这部分研究中，作者还使用IHC验证了来自三种免疫亚型的五种肿瘤的关键免疫标志物（CD3、CD68、CD163、PD-1和PD-L1）。
在早先的研究中，研究者在已知的免疫靶标中发现了差异表达蛋白（DEPs）和磷酸蛋白（DEPPs）。im1亚型中，免疫靶点的基因和蛋白表达水平显著升高，包括负调控免疫检查点（例如PD-1和TIM-3）、趋化因子（例如CCL2）、巨噬细胞特异性细胞因子（例如CSF-1）及其受体CSF-1R（图4A）。本研究确定了DEPs和DEPPs之间过度表达的通路。其中：
在im1亚型GBM中，包括免疫系统和小胶质病原体吞噬在内的通路大多与免疫有关；
在im2亚型GBM中，胶原形成和血管生成相关的蛋白表达上调；
在im3亚型GBM中，神经系统通路上调；
在im4亚型GBM中，细胞周期和胶质形成通路上调。
作者使用H&E染色切片的肿瘤切片样本，应用深度学习模型，分析了上述四种免疫亚型之间的形态学差异，其中，与其他亚型（im1-3）相比，im4亚型中有较多的大型细胞，其中一些是巨型细胞，而这些在im1-3亚型中分布很少。另外，在im1-3亚型中，约有20%的炎性细胞成分，而在im4中，这一比例仅为5%，而这其中涉及到的细胞和生物学相关性尚不清楚。
5．间叶性肿瘤及其微环境的特征
研究者利用CausalPath工具分析发现，在间叶性肿瘤中，缺氧相关通路发生上调，这表明HIF-1下游的多个靶点被显著激活，其中FLT1、MMP14、ENG和SERPINE1水平的上调表明间叶性肿瘤的血管生成也明显增加；同时还观测到STAT3、ICAM1、SPI1和CEBPB的上调对巨噬细胞的激活和极化的复杂调节。此外，M1极化标志物ARG1以及促进M2极化的SERPINE1和HCK蛋白的表达也有所增加。间叶性肿瘤的炎症反应增强可能导致缺氧或巨噬细胞极化的下游通过包括LANE、IL18和CD40在内的中间分子而被激活。
虽然GBM中间质信号的来源一直存在争议，但snRNA-seq数据能够识别肿瘤和免疫细胞中的间质特征。研究者发现EMT相关基因在nmf2样本的肿瘤细胞中上调（图4G），其中间质标志物CHI3L1和MET，以及其他EMT相关基因，如TNC、ITGA3和PDPN在肿瘤细胞中的表达水平最高。一些EMT相关基因也在非肿瘤细胞类型中表达，包括TAMS、T细胞、周皮细胞、内皮细胞和少突胶质细胞。然而，在非肿瘤细胞中，这些标记物的表达几乎没有任何差异。相应地，所有在肿瘤细胞中上调的EMT相关基因在nmf2型GBMs中也表现出RNA水平和蛋白水平的显著增加(图4G)。通过大量蛋白质组学检测，研究者发现，除了免疫浸润外，nmf2型GBMs明显具有间叶性肿瘤细胞的固有特征。
图4 四种免疫亚型中的细胞类型、免疫标记物和通路富集
（A）通过一致聚类分析确定四种免疫亚型的细胞类型特征、免疫检查点和潜在的免疫治疗靶点，通过整体的蛋白丰度、磷酸化水平和通路富集分析，作者发现不同的GBM亚型之间存在差异；（B）在18组GBM样本中观测到的snRNA-seq结果，OPC：少突胶质前体细胞；TAM：肿瘤相关小胶质细胞/巨噬细胞；VSMC：血管平滑肌细胞；（C）im1亚型样本与其余样本TAMs的差异表达基因，图中显示的是平均log2FC绝对值> 0.25的基因和经Wilcoxon检验FDR校正后的p值；（D）深度学习模型捕获到的功能特征，每个点代表测试样本中的H&E照片，根据预测得到的分数进行着色（红色：免疫反应高；蓝色：免疫反应低）；（E）im4亚型肿瘤的H&E拼接图像，箭头表示巨型细胞；（F）非im4亚型肿瘤的H&E拼接图像，箭头表示炎性细胞；（G）肿瘤细胞中nmf2亚型上调基因的snRNA-seq（左）和大部分蛋白表达情况（右）的热图。
6．组蛋白的乙酰化差异与特定的亚型和通路有关
组蛋白乙酰化调节基因表达，但在癌症中经常发生异常。本研究在组蛋白H1、H2A、H2B、H3.3和H4上检测到了30多个乙酰化位点。在所有样本中对这些位点进行非监督聚类，确定了具有不同乙酰化组蛋白H1、H2B、H3.3和H4的肿瘤亚型（图5A）。与正常样本相比，组蛋白乙酰化在肿瘤中普遍上调，其中一组肿瘤的H1、H3和H4乙酰化水平升高，而另一组肿瘤的H2BN末端位点的乙酰化水平显著升高（图5A）。
我们对组蛋白乙酰化位点与组蛋白乙酰化转移酶（HATs）、溴代域蛋白（或称溴代结构域蛋白，与肿瘤的发生和发展相关）（BRDs）和脱乙酰基酶（HDAC）的蛋白丰度和乙酰化丰度进行了Lasso线性回归分析。结果表明HATs和BRDs与H2B乙酰化位点之间存在联系，例如CREBBP和EP300蛋白和乙酰化水平分别与H2B-K12、K13、K16、K17和K21、H2B-K21和K24等大量位点具有相关性（图5B）。这些结果表明，某些肿瘤中H2B的高度乙酰化可能与CREBBP/EP300的活性有关。H2B乙酰化位点还与BRD1、BRD3和BRD4等蛋白的蛋白丰度和乙酰化水平相关，它们与乙酰化组蛋白结合并介导转录。本研究观察到H2B乙酰化与TME富集程度呈负相关（图5D），而其他组蛋白的乙酰化则与TME的富集程度呈正相关。此外作者还分析发现，一些与免疫浸润相关的通路，如铁死亡、肥大细胞和活性氧通路与H2B乙酰化呈负相关，而剪接体、核受体和类泛素化通路与H2B乙酰化呈正相关（图5C）。类泛素化通路中的两个关键蛋白——SUMO1和UBE2I在H2B乙酰化程度较高的样品中上调（图5E）。有趣的是，UBE2I与细胞周期调节因子CDK6中度相关，CDK6是一种UBE2I的作用靶点，并在类泛素化后稳定。这些观察表明H2B乙酰化有助于区分免疫细胞和其他类型的细胞。
图5 组蛋白乙酰化与免疫亚型和免疫通路的关联
（A）组蛋白和位点水平乙酰化的无监督聚类显示H2B、H3和H4在不同肿瘤聚类中的富集；（B）组蛋白乙酰化位点与组蛋白乙酰转移酶、脱乙酰酶和溴代域蛋白之间的显著联系；（C）与多组学获得的亚型或与组蛋白H2B、H3或H4乙酰化水平相关的通路；（D）xCell评分与组蛋白位点乙酰化的Spearman相关性；（E）SUMO1和UBE2I蛋白在高H2B乙酰化和低H2B乙酰化的样本中的表达。
7．与GBM亚型相关的脂质组成和代谢组学特征
作者在该研究中对75个肿瘤和7个GTEx正常样本中的582种脂类进行了定量（图6A），确定了在四种多组学GBM亚型中存在丰度差异的500多种脂类（图1 C）。间充叶型GBM样本显示三酰甘油（TGS）含量增加，以及磷脂酰胆碱（PC）和其他类型磷脂含量减少（图6A和6B）。原神经样亚型（proneural或称前神经样亚型）富含超长链脂肪酸（VLCFAs）和长链（LC）多不饱和脂肪酸（PUFAs）甘油磷脂（图6B）。至于代谢物，原神经样亚型显示肌酐和同型半胱氨酸水平显著升高，而L-半胱氨酸和帕拉金糖醇（palatinitol，又称巴糖醇，或益寿糖）水平则显著降低。
该研究还探究了含有22：4和22：6的脂类的丰度差异与它们代谢相关的神经保护蛋白之间的联系。图6C显示了22：6（可能是二十二碳六烯酸，DHA）和ACSL6（一种酰基-辅酶A合成酶）的协同调节。肿瘤样本中ACSL6蛋白表达显著降低（图6D），含DHA的磷脂酰甘油（PGS）和TGS的含量显著增加，而其他含磷脂酰乙醇胺（PE）和磷脂酰丝氨酸（PS）的脂质表达下调。此外，与间叶样亚型相比，原神经样亚型显示ACSL6以及含DHA的磷脂水平的上调。在DHA代谢方面，正常组织与原神经样亚型最为接近，与间叶样亚型差异最大。
H2B乙酰化相关途径分析发现间叶样亚型的GBM中，铁死亡通路上调（图5C）。例如，ACSL4和ALOX5（花生四烯酸5-脂氧合酶）仅在间叶样亚型中显著上调（图6D）。ACSL4将花生四烯酸（AA-20：4）和肾上腺素酸（Ada-22：4）结合到PE中，ALOX5则催化多不饱和脂肪酸的氧化，它们的上调可能表明这一亚型中氧化PE的含量较高。在这一亚型中，研究者也观察到含有多不饱和脂肪酸的完整的PE下调。研究者在与二酰甘油（DG）合成相关酶的背景下检测了DG水平（图6E），图6F显示DGs与AKT1、PLCD3和PLCG1蛋白表达显著相关；PLCG1磷酸化也受到EGFR改变的影响（图2B）。
作者比较了IDH-突变型和IDH-WT肿瘤的代谢物丰度，发现2-HG是IDH-突变型肿瘤中含量最高的代谢物（中位数log2FC=3.62，FDR<0.05），还有其他一些差异代谢物（见图6G）。参与糖酵解的几种代谢物在IDH-突变型中也表现出丰度的增加，而丝氨酸和谷氨酸水平则发生了下调。作者推测谷氨酸可能通过GLUD1和IDH1催化的反应促进α-酮戊二酸和2-HG的产生。这一可能的证据是：IDH-突变型肿瘤的GLUD1蛋白表达显著上调，与谷氨酸丰度呈负相关。实验结果也表明，GLUD1在IDH突变肿瘤中高表达（图6H）。
图6 主要的代谢通路和信号通路中的脂质组和代谢组数据
（A）在四种免疫亚型GBM和GTEx正常样品中检测到的所有脂质的平均丰度，所有的脂类按双键总数和侧链碳总数进行分类。（B）脂质微量富集分析亚型与其他亚型中上调脂质的性质。（C）激活多不饱和脂肪酸的酶（ACSL4和ACSL6）对磷脂池的贡献以及含多不饱和脂肪酸的PE与铁死亡通路的联系。（D）ACSL6、ACSL4和ALOX5在GBM多组学亚型和GTEx正常组织中的蛋白表达。（E）细胞信号所必需的脂质转换反应示意图。（F）DG、磷脂酸（PA）和磷脂酶C（PLC：将PIP2裂解成DG和IP3）、Akt激酶（与PIP3相互作用）、蛋白激酶C（PKCs：与DG相互作用）和DG激酶（DGKs：磷酸化DG以产生PA）之间的相关性；（G）IDH1突变型肿瘤样本表现出葡萄糖、糖酵解中间代谢物和2-HG的丰度增加，而谷氨酸和丝氨酸的丰度降低。（H）IDH1突变型肿瘤样本中GLUD1蛋白表达上调。CE——胆固醇酯；CL——心磷脂；Cer——神经酰胺；FA——脂肪酸；GP——甘油磷脂；Glc——葡萄糖；Glu——谷氨酸；HexCer——己糖神经酰胺；LCFA——长链脂肪酸；LacCer——乳糖基神经酰胺；MUFA——单不饱和脂肪酸；OEA——油酰乙醇胺；PCO——带烷醚取代基的磷脂酰胆碱；PEP（A组）——带有血浆原取代基的磷脂酰乙醇胺。PEP（G组）——磷酸烯醇式丙酮酸。PI——磷脂酰肌醇；PIO——带烷基醚基的磷脂酰肌醇；PIP——带血浆原取代基的磷脂酰肌醇；PLC——磷脂酶C；Pyr——丙酮酸；SM——鞘磷脂；SP——鞘脂类；3PG——3-磷酸甘油酸。
8．GBM的关键致癌途径和治疗机会
结合遗传改变和每种亚型的RNA、蛋白和磷酸化水平来研究GBM中的三个重要的致癌信号通路：RTK/RAS、PI3K/AKT和p53/细胞周期（图7A），研究者发现RTK通路中的表达异常的比例远远高于基因变异（图3）；此外，在被分析的肿瘤样本中，至少存在上述三条途径中的一种基因改变或异常表达。
在RTK/RAS途径中，经典型肿瘤主要表现为EGFR扩增，而神经性肿瘤和IDH突变肿瘤常表现为PDGFRA扩增，但两者均导致EGFR和PDGFRA的RNA、蛋白和磷酸化丰度升高，表明两者具有趋同的功能。此外作者还在间叶性肿瘤中观察到了MET蛋白丰度的上调和NF1蛋白丰度的下调。
在PI3K通路中，由于突变和缺失，原神经性、间叶性和经典性三种亚型肿瘤中PTEN的表达降低，可能通过磷脂酰肌醇（3，4，5）-三磷酸（PIP3）激活AKT1和AKT2。相反，AKT3在IDH突变和原神经型肿瘤中的表达更高，这是由AKT3在成人大脑中的活跃表达引起的。在p53/细胞周期通路中，作者观察到MDM2在间质中的特异性扩增和表达增加，MDM4在神经性和经典型肿瘤中的表达增加。本研究还观察了IDH、WT和CDKN2A/B突变肿瘤之间的差异。
结合DGIdb和Depo的成药性信息，研究者进行了激酶-底物和异常分析，以确定潜在的成药对（图7B），结果发现GSK3B的磷酸化与其下游，参与哺乳动物雷帕霉素靶标（mTOR）的信号转导（如RPTOR和TSC1）以及WNT信号转导（例如CTNNB1和APC）的蛋白磷酸化水平呈正相关。另一个参与mTOR信号转导的蛋白——AKT1S1与AKT1、AKT2和AKT3激酶有许多重要的联系。一项发表于2004年的研究还表明，EGFR能够使CTNNB1 N端S33磷酸化，进而介导CTNNB1蛋白酶体的降解。在该研究中，针对GSK3B、AKT1、MAPK1、MAPK3和EGFR的相互作用证实了这些发现上述结论。MAP激酶级联与多种蛋白相关，其中就包括ABL1激酶，而ABL1激酶又与HDAC2脱乙酰酶有很强的相关性（后者的异常值~5%）。并且，作者还发现HDAC2在S422位点的磷酸化也显著增加，这个结果与2015 Eom和Kook等人描述的其功能活性一致。
利用集成网络细胞特征库（LINCS），研究者计算了该项研究中RNA的特异性改变或蛋白磷酸化特征与相应的转录（L1000 assay）和LINCS的磷酸化信号（P100 assay）之间的相关性，以预测能逆转肿瘤特征的化合物。但研究结果表明，磷酸化蛋白质组数据比转录组数据更可靠。例如，虽然RNA的信号表明HDAC抑制剂可逆转EGFR信号，但磷酸化蛋白质组数据表明，是激酶抑制剂，而非EGFR抑制剂，与潜在的抑制作用联系更为紧密（图7C）；相反，NF1变异的GBM样本中，转录组和磷酸化蛋白质组的相关结果却是一致的。因此，本部分的研究结果表明，MAPK抑制剂是最佳候选药物（图7C）。
图7 通路改变和潜在治疗靶点的汇总
（A）GBM中三条频繁变异的致癌通路图，该图通过多组学亚型对每个基因的突变、CNV频率、RNA水平、蛋白水平和磷酸化水平进行了注释。每个基因所在的方框下方的横条表示所有肿瘤中的该基因的突变频率。在每条通路中，第一个百分数表示的是具有该基因突变的肿瘤的比例；第二个百分数表示的是该通路中蛋白质和磷酸化蛋白异常表达的肿瘤的比例。（B）所有肿瘤中RTK、PI3K、WNT和NOCH通路中磷酸化信号的异常调节。激酶-底物连接线的粗细表示激酶磷酸化的变化程度，这反映了磷酸化底物丰度的变化，线条颜色表示异常磷酸化样品的百分比。这些结果提示：磷酸化异常，并且控制多种底物的激酶，可能是潜在的治疗靶点。（C）基于转录组和磷酸化组，利用CLUA、iLINCS和P100方法，分析了20种最有效的增强剂或抑制剂的药物衔接性。
讨论
GBM是最早进行深度基因组、转录组分析和靶向MS研究的肿瘤。然而，目前大多治疗仍然采用的是近20年前制定的护理标准，因此有必要对GBM进行更深入的研究。本文拓展了经典的测序方法，并整合了基于质谱的蛋白质组学、磷酸化蛋白质组学、乙酰化组学、代谢组学和脂质组学分析以及单细胞转录组学。与传统的基于测序的组学研究相比，多组学分析能够区分生存期较短的，具有混合亚型的患者。磷酸化蛋白质组学数据表明PLCG1和PTPN11是多个RTK的共同信号中枢。
来自实体瘤的RNA和蛋白质表达数据表明，GBM亚型在浸润性巨噬细胞和特定免疫细胞类型的分布方面有所不同。本研究意外发现了一种免疫亚型——im3，它表现出GBM典型的特征：巨噬细胞-小胶质细胞免疫抑制浸润的相对减少，但含有大量的T淋巴细胞和自然杀伤（NK）细胞，并且也富集于IDH突变的肿瘤中。有趣的是，im1亚型中，TAMS显示M2的极化标志物，如CD163和MRC1的表达上调，表明这种上调在肿瘤促进中起作用。
间充质亚型有大量EMT信号的RNA表达，但尚不清楚这是由于肿瘤细胞本身还是大量浸润免疫细胞所致。本研究的数据表明，间充质亚型的肿瘤细胞表现出EMT信号的增强，同时肿瘤间质中免疫细胞的相对比例也有所增加。细胞类型特异性基因的表达表明，肿瘤细胞和间质成分都对整个间充质信号有贡献。这项研究还揭示了H2B乙酰化与GBM中与免疫细胞功能相关的蛋白表达模式之间的关系。此外，作者还将GBM的不同亚型和正常脑组织的脂质和代谢特征进行了比较，揭示了可能与神经元表型和IDH状态相关的共同特征。从代谢的角度来看，间充质样GBMs与其他亚型有很大的不同，并且具有其他亚型所不具有的代谢缺陷。
本研究所描述的对患者样本进行的多维分析，是对先前GBM基因组和转录组研究的重要补充，也为进一步的机制研究提供了理论指导。此外，单细胞基因组学和蛋白质组学技术的快速发展也将对GBM的异质性和TME相互作用的深入分析产生极大的促进作用。这些进展将改善临床治疗中的患者分型，将有助于个性化治疗。