科研| J AM SOC NEPHROL：膳食纤维通过短链脂肪酸介导的G蛋白偶联受体激活来预防糖尿病性肾病
编译：Mendelsohn，编辑：谢衣、江舜尧。
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既往已有研究报道了慢性肾脏病和糖尿病患者肠道菌群失调，例如纤维在肠道发酵产生短链脂肪酸(SCFA)的肠道微生物枯竭。膳食纤维与降低CKD的炎症和死亡率有关，而SCFAs已被提出介导这一效应。本研究中用链脲佐菌素诱导野生型C57BL/6和G蛋白偶联受体GPR43或GPR109a基因敲除小鼠糖尿病，探讨膳食纤维在实验性糖尿病肾病形成中的作用。糖尿病小鼠被随机分为高纤维、正常饮食或无纤维饮食，或在饮用水中加入SCFA，再使用质子核磁共振波谱进行代谢谱分析和16S RNA测序来检测肠道微生物群。结果显示：与正常饮食或无纤维饮食的糖尿病对照组相比，高纤维饮食的糖尿病小鼠发生糖尿病肾病的可能性显著下降，表现为蛋白尿、肾小球肥大、足细胞损伤和间质纤维化的缓解。纤维有助于重塑肠道微生态，改善了生态失调，促进了普氏杆菌属和双歧杆菌属产SCFA菌的增加，从而增加了粪便和全身SCFA的浓度。纤维饮食减少了糖尿病肾病小鼠编码炎症细胞因子、趋化因子和纤维化促进蛋白的基因表达。SCFA治疗可保护糖尿病小鼠以避免发生糖尿病肾病，但在缺乏GPR43或GPR109A的情况下没有保护作用。在体外实验中，SCFAs在高血糖条件下抑制肾小管细胞和足细胞的炎症。总而言之膳食纤维通过调节肠道菌群、富集产生SCFA的细菌和增加SCFA的产生来减少糖尿病肾病的发生。GPR43和GPR109A对SCFA介导的保护作用至关重要。针对肠道菌群的干预以作为糖尿病肾病一种新的肾脏保护疗法，值得进一步研究。
论文ID
原名：Dietary Fiber Protects against Diabetic Nephropathythrough Short-Chain Fatty Acid–Mediated Activation of G Protein–CoupledReceptors GPR43 and GPR109A
译名：膳食纤维可通过短链脂肪酸介导的G蛋白偶联受体GPR43和GPR109A的激活来预防糖尿病性肾病
期刊：Journal of American Society of Nephrology
影响因子：8.547
通讯作者：Huiling Wu
作者单位：悉尼大学
发表时间：2020年5月
实验设计
实验结果
1.膳食纤维对糖尿病肾病小鼠蛋白尿有保护作用。
为了评价膳食纤维对糖尿病肾病的影响，我们给WT糖尿病小鼠喂食含有标准纤维(Normal chow, NC)、零纤维(Zero Fiber, ZF)和富集纤维(Resistant starch, RS)的饲料，这些都可以改变SCFA水平。所有小鼠在接受注射STZ 12周后，在血糖升高(图1A)、体重变化(图1B)和进食量(图1C)都显示出类似的趋势。重要的是，与糖尿病对照组相比，饲喂RS或ZF并不能显著改变NC的血糖水平。
蛋白尿是糖尿病肾病的最早症状，反映肾小球滤过屏障受损，通过下游炎症和纤维化途径使疾病持续进展。注射STZ后12周，NC和ZF喂养的糖尿病小鼠出现进行性蛋白尿，明显高于非糖尿病对照组(U/ACR值分别为138.7±28和149.88±44vs86.5 6±29 mg/mmo1，P<0.0 1)。尽管有同等程度的高血糖，但RS喂养的糖尿病小鼠在12周时的U/ACr明显低于NC和ZF喂养的糖尿病小鼠(74.4±24比138.7±28和149.88±4 mg/mmo1；P<0.01)，与非糖尿病对照组比较差异无显著性(图1D)。
图1：抗性淀粉（RS）对糖尿病肾病小鼠蛋白尿有保护作用。
2.膳食纤维减轻肾脏肥大和肾小球损伤。
与非糖尿病WT对照组相比，糖尿病诱导的肾脏肥大在喂食NC和ZF的小鼠中很明显，肾/体重比增加。RS喂养可以防止肾脏肥大，与非糖尿病对照组相比，12周时肾脏/体重比没有明显增加(图2A)。光镜下病理显示，喂养RS的小鼠肾脏中的糖尿病改变有所减轻。PAS染色显示，NC和ZF喂养的糖尿病小鼠肾小球显著肥大、细胞增生，系膜基质增加，而RS喂养的糖尿病小鼠这些参数显著降低(图2B-E)。
糖尿病肾病的进展也以足细胞密度降低为特征，通常与蛋白尿平行，用WT-1与平均VG之比进行量化。12周时，喂食NC的小鼠与非糖尿病的WT对照组相比，每个肾小球的足细胞数量显着减少。喂养RS的糖尿病小鼠足细胞数量得以保存，与年龄相近的非糖尿病WT小鼠相似(图2F和G)。
3.膳食纤维减少肾脏纤维化和间质巨噬细胞募集。
细胞外基质成分，特别是胶原的积聚，是进展性糖尿病肾病的预后标志。Col-1在健康肾脏中低水平表达，但随着疾病进程而表达增加，从而导致纤维化。为了定量胶原沉积，切片用印天狼红染色和Col-1免疫染色。在NC喂养的糖尿病小鼠，胶原沉积显著增加，主要局限于肾小管间质，而这些变化在RS喂养后减弱(图2H-J)。
巨噬细胞是浸润糖尿病肾脏的主要免疫细胞，参与糖尿病肾脏损伤的进展。泛巨噬细胞标记物CD68的免疫染色显示，在第12周，喂食NC或ZF的糖尿病小鼠肾脏中的间质巨噬细胞数量显著增加。在喂养RS的小鼠中，CD68阳性细胞显著减少(图2K和L)。总而言之，我们的结果支持膳食纤维对糖尿病肾病的预防作用。糖尿病小鼠喂食富含瓜尔胶的高纤维饮食也能预防肾病，使这一结果更加确定。
图2：RS喂养可减少糖尿病肾病的肾小球和肾间质损伤。
4.膳食纤维降低糖尿病肾脏炎症和纤维化基因的表达
图3：RS降低糖尿病肾脏炎症因子和趋化因子mRNA的表达
5.膳食纤维改变了糖尿病小鼠的肠道菌群，改善了糖尿病小鼠的微生态失调
观察到膳食纤维可以减缓糖尿病肾病的发展，我们接下来研究所观察到的肾脏保护作用是否可归因于饮食诱导肠道微生物生态的改变。在注射STZ前后和维持治疗饮食后收集粪便。通过分析细菌16S rRNA测序来确定肠道菌群的组成。
我们首先用NC小鼠评估注射STZ前后肠道菌群的多样性和组成，虽然STZ因其对胰岛b细胞的细胞毒性作用，在研究中是最常用致糖尿病药物，但从嗜铬链霉菌中提取的STZ也具有抗生素活性。不出所料，STZ在注射后不久出现粪便细菌群落的多样性减少和破坏。然而，这种变化是相对暂时的，继续服用NC的小鼠在注射后3周后和饮食干预之前显示出菌群多样性的自发恢复。随机分到不同的饮食干预组后，正常纤维组、纤维补充组和纤维耗尽组的微生物组成均根据饮食类型的不同而出现两极分化，突出了饮食对肠道菌群的深刻影响。
糖尿病引起疾病相关的菌群失调，表现为12周时香农指数所表达的多样性较同等饮食的非糖尿病小鼠降低(P<0.007)(图4A)。糖尿病小鼠在门水平的细菌相对丰度发生了改变，与非糖尿病小鼠相比，表现为厚壁菌门和放线菌门增加，拟杆菌门减少(图4B)。在属的水平上，产SCFA菌如拟杆菌(产酸拟杆菌)、瘤胃球菌和里克氏杆菌的相对丰度减少(图4C)。糖尿病也与艾克曼属菌的减少有关，阿克曼属是一种粘液降解菌，是维持肠道完整性不可或缺的一种细菌。
为了评估膳食纤维对菌群失调的影响，我们分析了与糖尿病小鼠四种饮食相关的肠道微生物组成：NC：其纤维含量与人类推荐的相同；ZF；以及两种不同的高纤维饮食(RS和瓜尔胶直链淀粉)。主成分分析显示糖尿病小鼠按饮食类型有明显的聚类分离(相似性分析，P<0.001；R=0.93)(图4E)。每组小鼠的细菌在门水平的相对丰度如图4F所示。RS和高纤维饮食改善了糖尿病相关的生物失调，增加了拟杆菌门的相对丰度，但厚壁菌门的相对丰度减少。纤维喂养的糖尿病小鼠与NC喂养的对照组相比，产生SCFA的普雷沃特氏菌和双歧杆菌的数量增加，而嗜胆菌属(含已知的病原菌Bilophila wad sworthia)相对减少。高纤维饮食，而不是RS饮食，增加了糖尿病小鼠中粘液嗜酸杆菌的相对丰度(图4G)。
蛋白尿是糖尿病肾病的早期标志，为了鉴别与蛋白尿严重程度相关的细菌，我们使用了Pearson相关分析，结果如图4D中的热图所示。在科水平上，乳杆菌科、肠杆菌科、未分类的梭状芽孢杆菌和链球菌科与蛋白尿增加的相关性最强，所有这些细菌在喂食NC和ZF的糖尿病小鼠中都是最丰富的。相反，与较低水平的蛋白尿相关的“保护性细菌”主要在喂养RS或HF饮食的糖尿病小鼠中被发现。
6.膳食纤维促进SCFA的产生
7.SCFA是膳食纤维肾脏保护作用的关键调节因子
为了确定SCFA水平的变化是否能直接介导膳食纤维的肾脏保护作用，我们从注射STZ3周后开始用含有100 mM乙酸、50 mM丁酸或100mM丙酸的饮用水治疗糖尿病小鼠，同时维持对照组饮食。在饮用水中用乙酸处理的小鼠获得了与纤维喂养的小鼠相似的外周乙酸浓度，而全身酸碱平衡没有改变。与对照组相比，SCFA治疗组小鼠的蛋白尿、肾小球肥大、系膜扩张和间质纤维化均有减轻，对糖尿病肾病的进展有保护作用(图5)。与高纤维饮食的效果相似，对糖尿病肾病的保护伴随着足细胞数量的保存(图5，E和F)和间质巨噬细胞的减少(图5I和J)。我们以前已经证明，在饮用水中补充SCFA不会改变肠道菌群组成，支持SCFA在介导对糖尿病肾病保护方面的直接效果。
图5：SCFA（乙酸、丁酸、丙酸）干预可预防DN发生。
8.乙酸治疗可抑制糖尿病大鼠肾脏炎症和纤维化基因的表达。
为进一步探讨SCFA作用的分子机制，采用实时荧光定量PCR技术检测糖尿病大鼠肾脏炎症细胞因子、趋化因子和纤维化相关基因的表达。与非糖尿病对照组小鼠相比，WT糖尿病小鼠肾脏IL-6和IFN-γ mRNA表达上调，但在补充乙酸的小鼠肾脏中未观察到这种上调。在WT糖尿病小鼠肾脏中，趋化因子CCL2和CXCL10的基因表达也显著增加，但在补充乙酸的小鼠中则没有。补充乙酸盐也抑制了纤维化相关基因TGF β和纤维连接蛋白的表达(图6)。
图6：乙酸干预可降低糖尿病大鼠肾脏炎症和纤维化基因的表达。
9.乙酸和丁酸盐的GPR43和GPR109A是膳食纤维和SCFA介导的抗糖尿病肾病所必需的GPRS。
已知乙酸盐是一种选择性强的GPR43激动剂。补充乙酸盐的WT B6 Gpr43+/+小鼠在很大程度上避免了糖尿病肾病的发生，而Gpr43-/-小鼠没有受到保护，而是蛋白尿加剧(图7C)。接下来，我们测试了丁酸的主要受体GPR109A。在Gpr109A-/-小鼠中补充丁酸可部分保护糖尿病肾病，与糖尿病WT对照组相比，蛋白尿略有减少(图7D)。因此，乙酸介导的保护似乎依赖于GPR43，丁酸通过GPR109A和其他途径促进其有益效果。
为了确定膳食纤维对DN的有益作用是否通过同样的GPRS介导，WT C57BL/6 Gpr43+/+和Gpr43-/-糖尿病小鼠予RS喂养，这种饲料产生了我们研究中最高的SCFA水平。与WT对照组相比，RS喂养的Gpr43-/-小鼠在蛋白尿方面有一些改善(P<0.01)，但缺乏GPR43并不能解释高纤维饮食的全部保护作用(图7B)。
图7：GPR43和GPR109A为膳食纤维和SCFA介导的抗糖尿病肾病所必需。
10.SCFA处理抑制高糖暴露的TEC和足细胞的炎症反应。
为了确定SCFA对高血糖条件下肾细胞的影响，原代培养的TEC和足细胞在高糖和正常糖条件下分别用乙酸、丁酸或丙酸处理。与渗透压对照组相比，高糖暴露的TECs中促炎症细胞因子(IL6)、趋化因子(CCL2、CXCL10)和促纤维化基因(TGF-β、fibronectin)的mRNA表达增加了2-7倍。3种短链脂肪酸均可显著降低IL6、FI、fibronectin和TGF-β的表达。仅乙酸可降低CCL2和CXCL10的表达(图8A)。在足细胞中，IL6、TGF-β和fibronectin的上调同样被三种短链脂肪酸减弱。与TECs相反，足细胞TNFαmRNA的表达在葡萄糖作用下加剧，而在丁酸和丙酸作用下表达减弱。CCL2表达无明显差异(图8B)。
讨论
饮食是影响肠道菌群的主要外源因素，也是其组成和多样性的关键性决定因素。在我们的研究中，纤维摄入的变化导致了肠道菌群的明显变化，对无纤维、正常纤维和高纤维喂养的糖尿病小鼠进行主成分分析可证明了这一点。高纤维饮食改善了糖尿病相关的菌群失调，并促进产SCFA菌的增加，与NC喂养的糖尿病小鼠形成对比。我们还在糖尿病小鼠中检测到沃氏嗜胆菌（Bilophilawadsworthia）数量的增加，这是已知的一种产生脲酶的病原体，与小鼠肠道通透性增加和全身炎症有关。这些结果与CKD患者菌群失调的研究结果相平行，产生脲酶的细菌增加和产生短链脂肪酸的细菌减少是主要特征。在纤维喂养的糖尿病小鼠身上观察到的产生短链脂肪酸细菌的增加强调了饮食影响肠道微生物组成的能力。尽管如此，CKD患者使用益生菌、益生元、合生元的研究结果相互相互矛盾，因此需要更多的研究更细致地解读。
我们的两种高纤维饲料都引起了产SCFA的双歧杆菌属和普氏杆菌属的增加，但对艾克曼菌（Akkermansia）的影响却截然不同。随着越来越多关于肥胖的研究工作，艾克曼菌作为益生菌在小鼠代谢综合征、炎症和肠道通透性研究中的有益作用引起了人们的兴趣。与RS喂养的小鼠相对较低的丰度相比，高纤维饮食使菌群丰度增加3倍，但两者对糖尿病肾病的保护程度相似。这一发现突显了微生物生态系统的复杂性，并为没有单一物种负有责任的概念提供了支持，而饮食可以诱导微生物净变化，从而使平衡远离生态失调。
膳食纤维由共生结肠细菌发酵，肠道产生短链脂肪酸，通过门静脉循环入血以介导肠外效应。我们的高纤维饮食引起了微生物组成的变化，这与粪便和循环中SCFA水平的增加有关。全身性SCFA水平对膳食纤维的反应呈剂量依赖性，证实肠道微生物发酵纤维是影响循环水平的主要因素。与此相一致的是，我们的RS饲料含有最高比例的适合细菌发酵的不可消化纤维，产生的SCFA水平最高，其次是HF，然后是NC。补充SCFA重现了高纤维饮食对糖尿病肾病的有益影响，指出这些是肠道菌群-宿主串扰的关键介质。虽然先前的研究已经证明SCFA通过依赖AMPK、PPY和GLP-1的机制来改善糖耐量，但我们发现SCFA治疗的野生型糖尿病小鼠、Gpr43-/-或Gpr109a-/-糖尿病小鼠的血糖谱没有差异。这可能反映了这些研究是在2型糖尿病的高脂喂养模型中进行的。所发现的改进突出了SCFA对肥胖和胰岛素抵抗的影响，在我们的瘦身糖尿病小鼠中，这些作用没有产生葡萄糖方面得差异。
在分子水平上，SCFA通过多种机制介导细胞效应，包括GPRs、影响细胞增殖、凋亡和组蛋白乙酰化。GPR43和GPR109a表达在肠道上皮细胞和先天性免疫细胞上，这些细胞对结肠产生的SCFA有反应，表明GPR43和GPR109a在炎症和免疫反应中发挥着广泛的作用。我们和其他人之前已经证明SCFA-GPR信号通路对于调节共生细菌的免疫和炎症反应至关重要。这些受体在介导SCFA在糖尿病肾病中的重要性是显而易见的，其保护作用在GPR43和Gpr109a缺陷小鼠中无法完全复制。虽然乙酸盐治疗的益处在Gpr43-/-小鼠中被取消，丁酸盐在Gpr109a/-糖尿病小鼠中提供了部分保护，可能是因为它也能通过GPR43发出信号。对肾细胞系的研究已经证实了GPR的重要性，证明了它们存在于肾组织、血管和足细胞中。与我们在体内的研究结果一致，我们证明了在高糖条件下，SCFA处理能够减轻体外培养的TECs和足细胞的炎症。类似地，Huang等人发现高糖或LPS诱导的肾小球系膜细胞与SCFA或GPR43激动剂共同孵育，可抑制肾小球系膜细胞增殖，减少活性氧产生，减少MCP-1和IL-1b的表达，支持此通路作为糖尿病肾病的治疗靶点。
SCFA还独立于GPRS调节巨噬细胞产生炎症介质。Chang等人发现，丁酸盐处理巨噬细胞后，LPS和细胞因子刺激的促炎介质(TNF-α、IL-6和NO)的产生受到抑制，而抗炎细胞因子IL-10的释放增加。同样，我们发现用SCFA或高纤维治疗的糖尿病小鼠肾脏内巨噬细胞积聚显著减少，致病细胞因子和趋化因子的表达降低。在纤维喂养的小鼠中，天然免疫受体TLR2和TLR4的表达也减少了，这支持天然免疫和TLR通路的激活作为肠道菌群调节肾脏炎症和损伤的途径。
我们的研究是在使用STZ形成的1型糖尿病模型中进行的。由于STZ具有抗菌活性，对肠道菌群有混杂作用。为了排除这一点，我们研究了STZ的影响并发现肠道菌群在注射后会短暂改变，多样性和微生物组成在3周内基本恢复。我们的模型还有其他潜在的局限性，包括肾病发展后缺乏肾衰竭。因此，将结果外推至人体需要谨慎重，需要在其他小鼠模型中复制也是有必要的。
我们的结果提供了肠道菌群在糖尿病肾病中的重要证据，并支持肠-肾轴连接膳食纤维、肠道菌群、SCFA和肾脏疾病的假说。我们的研究还提供了机制方面的见解，表明膳食纤维和短链脂肪酸通过调节涉及先天免疫、炎症和巨噬细胞募集的关键途径和基因来保护糖尿病肾病。未来的研究需要确定饮食受否不仅可以延缓病情发展，还可以逆转既定的疾病。通过饮食控制来针对肠道菌群可调节能力的策略代表了一种新颖且经济有效的治疗策略，值得进一步探索。
评论
肠道菌群及其代谢物，特别是肠道微生物发酵纤维产生的短链脂肪酸，是包括糖尿病肾病在内的全身性炎症和代谢性疾病的新兴治疗靶点。作者发现，高纤维饮食或补充短链脂肪酸(醋酸、丁酸盐或丙酸)对糖尿病小鼠的肾具有保护作用。膳食纤维恢复了肠道微生态，纠正了菌群失调的变化，增加了短链脂肪酸的产量。缺乏G蛋白偶联受体GPR43或GPR109A的小鼠不受短链脂肪酸的保护，这表明保护是通过下游与这些受体的结合介导的。通过饮食挖掘肠道菌群的代谢潜力可能会提供一种新的方法来治疗糖尿病肾病。
原文网址：https://doi.org/10.1681/ASN.2019101029