科研| Plant Cell Environ：转录组和蛋白质组分析揭示了玉米种子组织在萌发过程中一种新型的氯化钠反应基因网络
编译：Emma，编辑：Emma、江舜尧。
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萌发是成熟种子的胚根开始穿透周围屏障成为幼苗的植物发育过程，多种环境因素都对其产生影响。目前还不清楚高盐度如何影响C4植物-玉米的种子萌发过程。初步萌发试验表明，在200mM NaCl处理下，独立的胚根能够萌发，而完整种子的萌发受到高度抑制。我们推测玉米胚乳可能具有感知盐信号并将其传递到胚等周围组织的功能，这与拟南芥表现出的反应完全不同。由于盐反应涉及到ABA（脱落酸），我们对体内ABA的分布和数量进行了分析，结果表明，与水分控制相比，NaCl处理的独立胚根ABA水平并没有增加，说明ABA水平的升高是一个依赖胚乳的过程。随后，通过使用RNA测序和基于SWATS-MS的定量蛋白质组学等先进的分析技术，我们发现盐处理的胚胎和胚乳在转录后和翻译变化方面存在显著差异。综上所述，我们的结果表明这些调控机制，如选择性剪接，可能介导了玉米种子萌发过程中对盐胁迫的早期反应。
论文ID
原名：Comprehensive transcriptome and proteomeanalyses reveal a novel sodium chlorideresponsive gene network in maize seed tissues during germination
译名：转录组和蛋白质组分析揭示了玉米种子组织在萌发过程中的一种新型的氯化钠反应基因网络
期刊：PLANT CELL AND ENVIRONMENT
IF：6.362
发表时间：2020.6
通讯作者：刘鹰高
通讯作者单位：山东农业大学生命科学院
实验设计
实验结果
1 实验条件、生理分析及分析流水线
对玉米(B73)种子进行增加氯化钠浓度的预处理，从50mm NaCl的处理组开始，发现盐对种子萌发有明显的抑制作用，到200mm NaCl处理组，玉米种子发芽率明显降低。因此，采用200mM NaCl作为后续转录组和蛋白质组的实验条件。选择单个时间点(盐处理后6小时) 和两个组织(胚乳和胚),研究种子萌发过程中组织对盐刺激的特异性反应。有趣的是，在200mM NaCl处理下，几乎所有分离胚(E组)都能萌发，而整个种子(W组)和半胚乳种子在如此高的盐浓度下萌发受到抑制(图1)，说明胚乳组织可能感受到了NaCl信号。脱落酸(ABA)对三个试验组的萌发均有抑制作用，而对照条件下赤霉素(GA)在对玉米萌发的影响较小，对NaCl处理的抑制作用稍有缓解。结果还显示，NaCl对半胚乳种子萌发的抑制作用比全胚乳种子弱。这些结果表明，玉米胚能够通过传递ABA信号来维持非萌发状态，但在萌发过程中却感受不到NaCl信号。此外，这也提出了一个有趣的问题，盐信号是如何在种子组织和下游调控网络之间转导的仍有待阐明。为探讨上述研究问题，我们应用了广泛的组学分析技术。与之前的研究相似，我们使用内部的生物信息分析途径对转录变化、转录后事件(PTE)和差异表达蛋白(DEP)进行综合分析。此外，以下结果总结了ABA和GA信号通路中涉及的基因以及剪接因子和转录因子等上游调控成分。
图1 不同刺激和激素处理下不同部位玉米种子的发芽率
(A) 3天不同处理下种子不同部位的萌发表型。不同的处理浓度:200 mM NaCl, 100μM ABA,200mM NaCl+10μM GA,10μM GA。bars=1cm。(B)不同处理(如A所述)3天完整种子、半胚乳种子和仅胚种子的发芽率。W,整个种子;H，没有半胚乳的种子;E,胚胎。不同字母(a-f)表示处理组间比较差异显(P<0.05,based on one-wayANOVA)。
2 在种子萌发过程中，大部分玉米基因在高盐度下进行转录后修饰
对短读长RNA测序(srRNA seq)数据进行分析，以阐明在NaCl处理期间胚乳和胚胎组织在转录和转录后的变化。大多数样本具有足够的测序质量和百分比。有趣的是，处理后6h与水分控制相比差异基因相对较少(图2A)。在盐处理的胚胎和胚乳中分别观察到57和148个差异表达基因(DEGs)。相反，主要的转录后事件被记录了下来，这表明转录后调控，如选择性剪接可能是玉米早期盐刺激反应中更主要的调控机制。与水处理相比，盐处理后的玉米胚和胚乳中分别检测到4529个基因和15023个基因的转录后差异表达事件(DPTEs)(图2A)。一般而言，每个样本中识别出约40000个转录后事件(PTEs)(图2B和S2)。特别的是，可变聚腺苷酸化(APA)占总PTE的50%，而另一个PTE, 可变转录起始(ATS)是12个样本中检测到的第二丰富的PTE(图2B)。随后的KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析显示，这两个组织可能通过不同的KEGG term进行富集(图2C)。如胚乳中参与亚油酸代谢的DEGs和参与核糖体生物形成的DPTEs富集，而胚胎中富含核糖体和蛋白酶体KEGG通路的DPTEs。尽管是相同的KEGGterm，例如剪接体、RNA传输和mRNA监测通路，在胚胎和胚芽数据集中都有富集，但在这些通路中观察到的独特基因与特定的组织类型相关(图2D)。代表性的DPTEs通过对每个剪接亚型的实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR,qRT-PCR)验证，这提示亚基因水平上发生了实质性的变化(图2E和S3)。这些结果表明，在盐刺激早期，玉米胚和胚乳对高盐胁迫的反应可能不同。此外，转录后的改变，如APA和ATS的引入以及选择性剪接可能是盐处理的主要调控机制。
图2 高盐度下玉米萌发过程中差异表达基因(DEGs)和差异表达的转录后事件(DPTEs)的比较
(A)用于数据集对比的维恩图。处理组:胚(E)和胚乳(R)组织具有水控制(CE或CR)和200mm NaCl(SE或SR)。(B)和识别所有样本中DPTEs的分类。ATS，选择性转录开始;APA,可变聚腺苷酸化;ALE，最后一个外显子可变剪接;AFE，第一个外显子可变剪接; SKIP，外显子跳读;IR,内含子保留；MSKIP，多重外显子跳读;MIR，多重内含子保留;AE5’，替代供体;AE3’，替代受体。(C)胚胎和胚乳组织中DEGs和DPTEs的KEGG通路富集分析。在胚胎和胚乳的数据集中反复发现“Bold”标记通路。(D)维恩图代表了KEGG term，剪接体，在胚胎和胚乳数据集之间的唯一共享位点。(E)确认DAS基因的代表性验证。植物群落主要转录模式标记为星形。左侧标记各转录子亚型(AS1、AS2和AS3)的百分比，右侧标记全基因和各亚型的表达水平通过qRT-PCR检测。**表示通过T检验该值显著高于或低于其控制组(P<0.05)。
3 质谱定量蛋白质组鉴定显示，在高盐度下，蛋白质组发生显著变化
为了进一步描述盐胁迫下的蛋白质组变化，我们对用于转录组分析的相同样本进行了基于SWATH-MS的蛋白质组定量分析。在本例中，从159,195个高质量质谱中共鉴定出2,767个蛋白(1% FDR)。其中2429例采用之前使用的无标签定量方法进行了定量，这表明本研究获得了更多的蛋白质。与水处理相比，盐处理的胚胎中分别有243个蛋白表达上调和和419个蛋白表达下调(图3A)。此外，与水分对照相比，盐处理玉米胚乳中有389个蛋白被诱导,234个蛋白量减少(图3A和表S5)。鉴于每个数据集中识别了大量DEPs，我们进行了GO（geneontology）富集分析，以识别盐胁迫下富集的生物过程(图3B和表S6)。虽然不同的处理组共享一些GO term,GO类别如线粒体被膜(GO:0005740),内质网(GO:0005783)和蛋白酶体核心复合体(GO:0005839) 唯一富集在胚乳上调蛋白中 (图3 b和表S6),显示了在高盐度玉米胚乳中有独特的基因参与在这些GO term的不同功能里。此外，我们观察到DEG和DEP数据集之间有一小部分重叠，这意味着这里发现的大多数DEP可能不是初始基因表达的直接翻译产物。选定DEPs对其不同亚型的转录水平进行验证(图3C)，揭示了在亚型水平上的复杂调控。
图3 盐萌发期间玉米胚和胚乳组织差异表达蛋白(DEPs)数据集比较
(A)维恩图表示四个处理之间的独特和共享蛋白。(B)蛋白质组数据集中四种处理之间的基因本体富集分析。(C)对鉴定的DEP基因及其剪接亚型进行qRT-PCR验证。植物群落主要转录模式标记为星形。标记每个转录亚型(如AS1、AS2或AS3等)的百分比，同时显示整个基因和每个亚型的表达水平。**表示通过T检验该值显著高于或低于其控制组(P<0.05)。
4 NaCl处理下ABA-和GA-相关基因的综合分析
植物激素、ABA和GA是介导盐刺激的主要内部响应信号。因此，在RNASeq和SWATH-MS蛋白质组数据集中筛选了涉及这两种激素的代谢、信号传导和下游靶基因的相关基因(图4，表S7和S8)。有2个DEGs、2个DEPs和96个DPTEs被鉴定为ABA相关(表S7)，而2个DEPs和12个DPTEs被鉴定为GA相关(表S8)，说明在盐处理中这些激素基因主要发生了转录后变化。有趣的是，5个处理组中只有少数基因是共享的，包括胚乳DEGs、胚胎和胚乳DPTEs和胚胎和胚乳DEPs(图4A)。可以预期，大部分激素相关基因位于两个DPTE数据集中(图4B, D)，只有两个ABA相关的基因出现在盐处理胚乳的DEGs列表中(图4C)。具体来说,一个ABA的生物合成基因, GRMZM2G127139 (ABA1/LOS6/ZEP)，被发现在盐处理下在转录和转录后水平上都被持续抑制。而另一个ABA应答基因，GRMZM2G162659(EM1)，在盐处理下转录水平上调，蛋白水平下调。相比之下，在5个处理组中没有观察到GA相关基因的共享。
图4玉米盐萌发期间激素相关基因的鉴定与比较。
(A)维恩图表示五个处理组之间独特和共享的基因。5个处理间玉米ABA(B、C)和GA相关(D)基因的综合比较。
5 免疫荧光显示，在盐处理下，玉米胚乳只对ABA 敏感
从转录组分析和蛋白组分析中可以观察到ABA和GA相关的差异表达基因和蛋白的较大表达变化(图4),独立实验验证采用ABA免疫荧光、液相色谱-质谱(LC-MS)为基础的ABA定量和定量ABA和GA基因表达。免疫荧光检测了不同玉米种子组织中ABA的含量，结果表明，完整种子中胚乳中的ABA含量高于胚乳。此外,盐处理增强了ABA的积累，特别是胚胎组织完整的种子和没有半胚乳的种子(图5A,B)。然而,单独使用分离胚时，盐处理并不能诱导ABA水平的升高(图5A、B)。类似的结果也可以通过使用一个独立LC-MS方法进行ABA含量量化得到(图5)。此外，利用不同组织样本对ABA和GA相关基因进行了qRT-PCR表达分析(图6)。一般情况下，在盐胁迫下，ABA生物合成相关基因不受影响，而ABA代谢基因则受到下调(图6A,B)。盐胁迫下，从全种子(1-4组)和没有半胚乳的种子(5-8组)的胚胎和胚乳中均发现了ABA响应基因ABI4。相比之下，使用分离胚胎(第9组和第10组)进行盐处理时，未发现该基因的诱导(图6C)。另一个ABA应答基因ABI5在各处理组间没有显著差异(图6D)。此外，我们观察到一个GA生物合成基因(KS1)在盐处理下也受到了不同的调控(图6E, F)。
图5 NaCl促进胚胎中ABA的积累
(A)种子横切面和纵切面的ABA免疫荧光。W-T，整个种子的横切面;H-T，没有半胚乳的种子横切面;W-L，整个种子的纵向切片; W-E-T，全种子胚的横切面;H-E-T，没有半胚乳的种子胚横切面;E-T，只剩下胚的种子横切面。NaCl浓度，200mM。(B)图a中部分荧光总荧光强度的折叠变化。星号(*)代表与0 mM相比的显著性差异(P<0.05，基于T检验)。(C)玉米种子经过200mM NaCl处理后ABA含量的检测。W-EM,全种子胚;W-EN,全种子的胚乳;H-EN，没有半胚乳种子的胚乳;H-E,没有半胚乳的种子胚;E，无胚乳的种子胚。星号*表示通过T检验该值显著高于或低于0mM(P<0.05)。
图6 NaCl处理下ABA生物合成基因、信号转导基因和代谢基因以及GA生物合成基因的表达。
(A)到(C)在200mM NaCl或处理下ABA生物合成基因、ABA代谢基因和ABA信号基因的表达水平。(E)和(F)200mM NaCl处理下GA生物合成基因的表达水平。值代表±SE，(n=4)。1-10表示水分控制和NaCl处理下种子的不同部分。(1)整个种子的胚用水处理;(2)整个种子胚用200mM NaCl处理;(3)整个种子的胚乳用水处理;(4)种子胚乳200 mM NaCl处理;（5）没有半胚乳的种子胚用水处理(6)没有半胚乳的种子胚用200mm NaCl处理;(7)没有半胚乳的种子胚乳用水处理;(8)没有半胚乳的种子胚乳用200mM NaCl处理;（9）单胚水处理;（10）单胚用200mM NaCl处理。
6 剪接因子和转录因子都像DPTEs一样受到调控
鉴于转录调控转录因子和选择性剪接调控剪接因子在决定不同处理组的蛋白含量变化方面的至关重要，我们根据所获得的组学数据编制了一份列表(转录因子(TF)和剪接因子(SF))(图7)。在两个组织DPTE数据集中，我们发现了30个亚组的200多个剪接因子和48个组的200多个转录因子(图7)，说明SFs和TFs在高盐度的情况下都经历了大量的转录后调控。有趣的是，超过20个剪接因子被发现为DEPs(图7A和表S9和S10)，而在胚胎DEP列表中只发现了两个转录因子(图7B)，这意味着早期盐反应的功能调控可能主要集中在剪接及其调控因子SFs上。此外，在胚乳和胚胎中，NaCl也下调了几个与乙烯相关的TFs(图S4)。
图7 玉米剪接因子和转录因子在种子萌发过程中参与高盐度反应的概述。
在盐萌发过程中鉴定出的玉米剪接因子(A)和转录因子(B)的维恩图。DPTEs中剪接因子(C)和转录因子(D)的亚组分类。
讨论
干旱、低温或高温、高盐度等非生物因素严重影响植物生长的各个方面。其中一个方面就是幼苗的萌发。萌发是一个重要的农学性状，是植物开始生长的重要事件。因此，破译玉米种子对盐胁迫的调控机制对于理解植物对盐碱环境的反应具有重要意义，这可以用来诱导耐盐作物的萌发机制，从而在这些不利条件下建立幼苗。在本研究中，我们发现，在萌发种子的胁迫下，盐胁迫能够引起胚和胚乳转录组以及蛋白质组的剧烈变化。在早期，盐处理下的反应(盐处理后6小时)，转录后和翻译调控可能比转录发挥更重要的作用。生理和免疫荧光实验表明，玉米种子胚乳，而不是胚胎，可能参与盐信号的感觉和向周围组织的传递。而盐诱导胚胎的ABA水平高于胚乳，这与双子叶植物拟南芥完全不同。然而，这一过程的潜在机制还有待进一步阐明。
1 ABA被认为是玉米盐萌发过程中最主要的响应性植物激素
ABA在非生物应激反应中发挥多种作用的研究由来已久。其抑制种子萌发的作用已经被成功鉴定。在本研究中，ABA被认为是一种对高盐浓度有反应的主要激素。在胚乳和胚胎中，盐都升高了其ABA水平(图5)。然而，当从种子中去除胚乳时，高盐度并不会导致胚胎ABA含量升高(图5)，这表明在种子萌发过程中，高盐度的胚乳在感知和向胚组织传递信号方面起着至关重要的作用。此外,研究表明，在盐处理下，参与ABA生物合成、代谢和信号通路基因的剪接模式和蛋白质丰度都会发生显著变化，这意味着整个过程中ABA通路受盐处理的积极调控，特别是在转录后和蛋白水平上(图4)。如前所述,拟南芥胚乳会产生高浓度的ABA以应对不利的环境条件，抑制胚胎萌发。因此，盐处理下的玉米种子情况不同。虽然有报道一些参与盐调控萌发的分子成分，如AtGASA6、AtRAS1和CsHMGB，但盐胁迫的调控网络仍有待进一步研究。
2 转录后翻译在玉米种子萌发的早期盐反应中起着关键作用
最近的RNA测序分析表明，选择性剪接等转录后调控扩展了转录组多样性，可能参与水稻种子缺氧萌发过程中的应激响应途径。在本研究中，我们整合了转录组学和蛋白质组学的方法，系统地揭示了种子萌发早期盐处理的多层次调控网络。我们的数据表明，数千个基因产生转录亚型，数百个蛋白质在盐处理下有表达差异。特别是，与之前使用其他蛋白质组学方法(如2-DE-MALDI-TOF MS/MS和gel-free shotgun proteomics)的研究相比，基于SWATH-MS的定量蛋白质组学显示出了识别更多DEPs的优越能力，从而为通路分析和进一步功能研究提供了额外的蛋白靶点。此外，同时使用转录组和蛋白质组数据将有助于建立盐胁迫下种子萌发的转录后调控机制。因此，考虑到干燥种子含有大量存储的mRNA前体物，我们推测可能是转录后和翻译调节对即时盐胁迫的反应快于转录调节。特别是，RNA转运、剪接体和RNA监控等KEGG通路在转录后调控中高度富集(图2C)，表明了剪接机制的激活和RNA监测在高盐度下的响应。此外，在胚胎和胚乳中观察到了20多个剪接相关蛋白在蛋白水平上的表达差异。此外，我们观察到20多个剪接相关蛋白在蛋白水平上在胚胎和胚乳之间表达差异(图S4)。12个蛋白质之间共享的这两个数据集,其中11个蛋白在玉米胚乳和胚之间表达模式存在差异，提示这些蛋白可能是阐明盐胁迫下玉米胚乳和胚胎之间生理反应差异的上游调控因子(图S4A，B)。此外,几种转录因子在蛋白水平上的表达差异(图S4C, D)提示它们在长期盐胁迫下可能会激活或抑制下游靶点。有趣的是，两个TFs如GRMZM2G055180和GRMZM2G040481被鉴定为乙烯反应转录因子，提示乙烯参与了玉米的盐萌发过程。然而，这一过程的关键调控者仍然有待阐明。
3 盐胁迫下盐传感和信号转导的模型和展望
总结我们在本研究中获得的结果，外部的盐信号将启动玉米胚乳转录后和翻译后的重大变化(图8)。在翻译水平上，差异积累的SFs可能导致不同类型TFs之间剪接亚型的重大变化。而这些激活的TFs又会激活ABA或GA相关通路的下游基因。盐处理的玉米胚胎也出现了类似的情况。额外的响应信号可能通过未知成分转导到胚胎，在不同批次的基因和蛋白质上引起转录后和翻译水平上的重大变化。随后，胚和胚乳组织中的ABA水平升高，以维持玉米种子不发芽的状态。特别是最近的研究表明，种子萌发可能是由不同空间的代谢过程协调驱动的。这些候选代谢物是否能将盐信号从胚乳转化到胚胎还有待进一步研究。此外，由于基因组标注的差异，蛋白质基因组学等替代方法可能会极大地提高对玉米种子早期盐反应关键成分的鉴定。
图8 玉米盐萌发途径的转录后和翻译调控模型
氯化钠在玉米胚乳和胚胎组织中的反应机制模型。TF,转录因子;SF,剪接因子;ABA，脱落酸;NaCl,氯化钠。
总结
总之，本研究提出了玉米种子盐传感和信号转导的新模型。我们的转录组和蛋白质组研究揭示了种子萌发时三个层次的调控，包括转录，转录后和翻译。总结了几条现象。首先，我们认为剪接因子和转录因子蛋白质丰度的变化对早期盐胁迫的反应至关重要。第二，大量的转录后改变，如选择性剪接，是对盐的主要反应机制。第三，与ABA和GA相关的基因被集中作为调节玉米种子激素稳态和维持种子不发芽状态的主要靶点。本研究开发的途径可用于寻找特定发育过程或应激反应主调节因子的相关研究。