科研 | 沈阳农业大学：基于费氏中华根瘤菌的蛋白质组学分析揭示了生防剂菌株在增强大豆对大豆孢囊线虫抗性方面的作用（国人佳作）
编译：晨晨，编辑：Tracy、江舜尧。
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全球范围内的大豆生产受到了大豆胞囊线虫(SCN)的严重威胁，生物防控剂是控制病原体的生态友好型候选物。前期研究表明，生防菌Sinorhizobiumfredii Sneb183可能诱导大豆对SCN产生抗性，为了研究Sneb183诱导植物抗病性的机制，我们将大豆种子进行Sneb183发酵液或水处理，基于iTRAQ蛋白质组学方法鉴定大豆根的蛋白质组学变化。与对照组相比，Sneb183处理的样品中差异表达蛋白总共456个，其中212蛋白上调、244个蛋白下调。一些差异表达蛋白可能参与苯丙酸、黄酮、黄烷醇和异黄酮的生物合成，在抗病和适应环境胁迫中发挥作用。我们使用qRT -PCR分析了异黄酮生物合成的关键基因，包括GmPAL(苯丙氨酸解氨酶)、GmCHR(查尔酮还原酶)、GmCHS(查尔酮合酶)和GmIFS(异黄酮合酶)，结果表明，这些基因在Sneb183处理组中的表达水平高于对照组。高效液相色谱分析进一步表明，Sneb183处理组中大豆苷元的含量比对照组高7.24倍，这些结果表明，Sinorhizobium fredii Sneb183菌株可能具有诱导异黄酮生物合成的作用，从而增强大豆对SCN感染的抗性。
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实验设计
1.分离SCN的胞囊,培养SCN的J2。
2.实验组：对大豆种子进行Sinorhizobium Fredii Sneb183发酵液包被。对照组：对大豆种子加蒸馏水处理。萌发一周后分别进行四组处理：(1) Sneb183,(2) J2,(3)Sneb183+J2,(4) CK。分别在第3,7, 14, 21和28天取样。
3.蛋白水平分析：蛋白质提取、定量、iTRAQ进行蛋白质组分析、质谱鉴定及蛋白注释。
4.qRT-PCR验证类黄酮合成过程中的关键基因的表达。
5.使用HPLC分析类黄酮含量。
实验结果
1.通过iTRAQ鉴定蛋白质
我们用iTRAQ-LC/MS-MS分析了四种处理的大豆根系蛋白质组的变化，根据大豆蛋白质数据库进行查询分析，在总共443，104个蛋白谱中，有25，406个可以与数据库匹配，有4，193个肽组装成1，366个蛋白质组。
水平线上下的数字表示上调或下调蛋白质的数量。重叠区域表示共有蛋白质的数量。在390个DEPs中，Sneb183 +J2 vs. J2组有193个上调，197个下调；Sneb183 vs. CK组有199个上调，191个下调。
2.蛋白质注释和富集
我们使用BLAST数据库对Sneb183+J2 vs. J2的所有DEPs进行基因本体注释。蛋白质编码基因的GO注释的结果表明，共有2832个GO术语，包括979个生物学单词、568个细胞单词和1285个特征术语。在代谢过程、结合、催化活性、细胞过程和细胞部分分别有78、520、507、448和294个基因富集(图2)。这一结果表明，Sneb183可能通过影响大豆的代谢过程来提高大豆对H. glycines的抗性。
KEGG研究表明，在456个DEP中有337个参与118个代谢途径；一些蛋白质同时参与多种代谢途径，表明这些蛋白质具有多种生物学功能。已鉴定的DEPs在一些与植物抗病性和适应环境压力相关的代谢途径中富集(图3)，如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成(map00400)、类苯丙酸生物合成(map00940)、类黄酮生物合成(map00941)以及黄酮和黄烷醇生物合成(map00944)。四种DEPs上调与异黄酮代谢途径有关(图4)。然而，需要进一步的研究来调查与其他DEPs相关的代谢途径。
图2（Sneb183+J2)处理组与J2处理组的所有差异表达蛋白质的基因本体注释
图3（Sneb183+J2)处理组与J2处理组的每种代谢途径中的DEPs数目
图4（Sneb183+J2)处理组与J2处理组中与异黄酮生物合成途径相关的DEPs
不同颜色反映了蛋白质丰度的变化。
3. 一些蛋白质在mRNA水平上参与异黄酮生物合成的调节
Sneb183诱导大豆具有SCN的抗性，且参与黄酮和异黄酮类生物合成途径的一些DEPs富集，我们用qRT-PCR进一步分析验证异黄酮生物合成途径中的关键基因，包括GmPAL、GmCHS、GmCHR和GmIFS(图5)。
在第7天后，与对照组相比，J2/Sneb183/Sneb183+J2处理组中GmPAL的转录显著且持续增强。GmPAL的转录水平在第3时没有差异。第7和14 天时，GmPAL在Sneb183+J2中的表达比J2处理在相同时间点的表达分别增加了1.42倍和1.51倍。与对照组相比，J2、Sneb183和Sneb183+J2处理组的GmPAL转录增强，且处理之间没有差异，在四个处理中，GmCHS和GmCHR的转录水平具有相似的趋势。在第3天时没有观察到差异；然而，在7和14 天时，GmCHS在Sneb183+J2中的表达显著高于在CK、J2和Sneb183中的表达，GmCHS在Sneb183+J2中的表达水平比J2高5.89倍，在第7天达到最高，第14天时，GmCHR在Sneb183+J2中的表达水平比J2高2.18倍，然而，在第28天时，两种处理的GmCHS和GmCHR表达水平略有下降。
GmIFS的表达模式如下:在每个处理中，线虫发育的早期(第3和7 天)表达水平高于后期(1第4、21和28 天)；在第7天，Sneb183+J2处理组中GmIFS的表达水平最高，比J2高1.56倍，与其他处理有显著差异。
图5 RT-PCR分析根中异黄酮合成途径中的关键基因
在H. glycines侵染大豆后的第3、7、14、21和28天，分析来自四个处理（CK、J2、Sneb183和Sneb183+J2）的基因表达水平。将每个时间点的相对转录水平与对照组进行比较。对于每个基因和时间点，不同字母表示不同处理之间有显著差异。
4.大豆根中染料木黄酮和大豆苷元含量的测定
Sneb183包衣种子影响异黄酮生物合成途径中编码关键酶的基因表达，这种修饰是可能导致异黄酮浓度的显著变化，因此，我们用高效液相色谱法测定了四种处理的大豆根中两种异黄酮(染料木黄酮和大豆黄酮)的含量，如图6所示。
从第7天开始，大豆根中染料木素的含量逐渐增加，与其它处理相比，用Sneb183发酵液包衣种子在第7天时染料木黄酮含量显著增加。在对照组中染料木黄酮含量在第21天达到峰值，而在J2和Sneb183处理中，染料木黄酮积累速度加快，分别在第14天和第7天达到峰值，大豆苷元的含量高于在同期各处理中的染料木黄酮含量；在第7天时，大豆苷元的含量与其他处理相比有显著差异，大豆苷元的含量在Sneb183和Sneb183+J2处理的21天前一直稳定增加，随后显著增加。与对照组和J2相比，接种或不接种线虫的所有包衣处理中大豆苷元含量在21天后显著增加；在第35天，Sneb183处理组中大豆黄酮的含量比对照组中的含量高7.24倍。
图6 大豆幼苗在不同时间点的染料木素和大豆黄酮的含量
结论
众所周知，大豆是世界上重要的经济豆类。大豆胞囊线虫对大豆生产构成了严重的危害，很难从土壤中完全清除大豆胞囊线虫，大量研究表明用PGPB包衣种子，如Rhizobium etli, Bacillus firmus,B. subtilis, B. simplex, Klebsiella pneumoniae诱导了对线虫病的抗性。已有的研究证实，S. fredii Sneb183通过种子包衣在裂根中产生ISR，用Sneb183发酵液进行种子包衣后显著减少根上的孢囊，种子包衣是一种经济高效的方法，具有很强的可操作性，在不改变其基因组序列的情况下使植物获得了广泛的抗性。
本研究基于iTRAQ对大豆根进行比较分析，以研究Sneb183诱导的大豆对SCN的抗性。据报道，在植物对根瘤菌的反应中，诱导并积累异黄酮、植物防御酶、酚类物质或其他植物抗毒素能够保护植物免受植物病原体的侵害，植物通常使用黄酮和异黄酮类化合物防御寄生线虫。在本研究中，我们取样后将幼苗移至装有灭菌土壤的盆中，以防止J2s的进一步入侵，植物寄生线虫通常需要3-7天才能通过根分泌物信号进行迁移、定位和穿透宿主根。为了进一步研究J2是否完全侵入了大豆根，我们使用iTRAQ对蛋白质组进行了分析，研究结果表明，在代谢过程、结合、催化活性、细胞过程和细胞部分中分别富集了578、520、507、448和294个基因。Sneb183 +J2引发了大豆根中蛋白质类型的差异，其中一些蛋白质与黄酮和异黄酮的合成有关。
苯丙氨酸解氨酶（PAL）是类苯丙酸途径中的初始酶，能催化L-苯丙氨酸的前体转化为肉桂酸产生类苯丙酸化合物，从而诱导对病原体的抗性，在高等植物中，PAL的催化活性影响异黄酮类生物合成的效率。我们在Sneb183 + J2与J2中确定了五个PAL表达增加，这些蛋白为理解大豆对Sneb183诱导的抗性提供了新的见解。当植物受到病原体攻击时，反式肉桂酸酯4-单加氧酶(C4H)，参与多种多酚化合物的合成，如黄酮、异黄酮和木质素。本研究中酶的积累可能与黄酮和异黄酮类物质的积累有关，且增强了细胞壁木质化和大豆抗性。
在不同阶段，异黄酮合成途径中关键酶的基因(GmPAL、GmCHS、GmCHR和GmIFS)表达上调，并诱导异黄酮类化合物的合成和积累，四个处理间的诱导过程和异黄酮含量有所不同。GmIFS在Sneb183处理大豆根后的第3天表达上调，作用于异黄酮生物合成中相对较晚的一步，能利用大豆中的前体合成染料木黄酮；在Sneb183处理后的第7–21天，GmCHR和GmCHS的表达开始上调，合成类苯丙酸的前体；与对照组和J2组相比，GmCHS和GmCHR的转录增强，染料木黄酮和大豆苷元的生物合成迅速增加。
SCN和S. frediiSneb183都引发植物产生抗性并促进异黄酮积累，有趣的是，在这四种处理中，由Sneb183引发了两种异黄酮的积累，接种Sneb 183和SCN入侵引起大豆抗性的程序明显不同；同时，染料木黄酮和大豆苷元在大豆抗性中共同作用，以减少线虫入侵并抑制线虫在大豆根中的发育。据报道，大豆中产生的染料木黄酮和大豆苷元的含量分别为50%和40%，但本研究中，经Sneb183处理后大豆苷元的含量超过了染料木黄酮的含量。染料木黄酮使得线虫畸形，影响探针穿刺和吸取营养。与染料木黄酮相比，大豆苷元的含量在处理的后期迅速增加，虽然没有明确的证据支持大豆苷元在线虫中的基本功能，但在本研究中我们发现大豆苷元可显著杀死并抑制卵孵化，已有研究表明，异黄酮通过影响SCN性别比例和雌性卵子的数量来阻止其繁殖。在第35 天，染料木黄酮和大豆苷元含量达到峰值，表明Sneb183引起的抗性是相对持久的。我们使用Sneb183进行种子包衣，感病品种Liaodou15获得了广泛的抗性且能立即对SCN作出反应，具有SCN抗性大豆的异黄酮含量显著高于SCN敏感型。
总之，使用Sneb183发酵液种子包衣诱导了植物抗性，本研究首次报道Sneb183诱导大豆合成异黄酮，共鉴定出456个与诱导异黄酮合成途径中关键基因表达相关的DEP。我们采用高效液相色谱法分析大豆根中异黄酮类化合物的含量，结果表明，Sneb183可以诱导并调控大豆根中染料木素和大豆苷元的合成。本研究的结果表明Sneb183是一种对抗H. glycines的潜在生防剂。