综述 | HUM REPROD UPDATE：男女性生殖道菌群的组成特征分析
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人类微生物组已经成为过去十年内该领域内的热点话题。下一代测序技术（NGS），全基因组学测序技术以及红基因组学技术由于不依赖于菌株的可培养技术已经可以协助科研人员对微生物组进行详细的分析。基于这类新技术的分析发现人类表面存在非常丰富的微生物，比如生殖道。但是微生物组成分析非常依赖于所使用的测序以及分析技术，因此很难对不同团队的分析结果进行准确的比较。本文综述了自2005年“下一代测序技术问世至今有关男女性生殖道微生物组的分析方法以及分析结果。这些结果有助于我们分析哪些微生物有助于提高受孕率，并且这些关键的微生物的作用是什么以及考察它们之间是如何发挥相互作用的。基于以上的实验目的，我们对Embase, Medicine Ovid, Web of Science, Cochrane and Google 学术等5个数据库中中的相关研究进行了分析。由于时间以及技术的限制，本文所筛选的期刊全部是英文撰写，并且是发表于2005至2018年自建的成果。所有的研究文章全部是针对生殖道微生物的研究性论文。但是由于各个研究采用的方法之间的差异，我们很难对分析结果进行有效的总结（比如分析过程、取样方法、引物设计、测序技术以及生信分析的方法等）。虽然目前我们也发现了有些微生物与成功受孕以及分娩有相关性，但是目前还不知道这些微生物的组成是否是导致受孕以及分娩的关键性因素。因此为了解决以上的问题，我们还需要对更多临床的数据进行分析。
论文ID
原名：Identification and evaluation of the microbiome in the female and male reproductive tracts
译名：男女性生殖道菌群的特征分析
期刊：Human Reproduction Update
IF：11.582
发表时间：2019年
通信作者：Schoenmakers, S
通信作者单位：Erasmus Univ, Med Ctr, Dept Obstet & Gynaecol, NL-3015 CN Rotterdam, Netherlands.
综述内容
前言
微生物组
人体的微生物数量与自身细胞的总量是处以同一数量级的（Sender，2016）。定植于我们体内的微生物主要包括细菌、病毒、真菌、酵母、古细菌以及原生生物等。微生物中的遗传新意及其周边环境组成了微生物组（Marchesi and Ravel，2015）。有研究者认为宿主内的微生物以及自身的细胞应该可以看做是一个完整的生态学以及生物学单位，也就是我们俗称的人类全息图。宿主以及微生组之间的关系可以分析偏利型（某一种类微生物受益，而不影响另外的微生物），互利型（宿主以及微生物之间互利共赢）以及寄生性（微生物以消耗宿主内的能量而生存）三类（Bordenstein 和 Theis，2015）。
微生物的多样性是指某一位置含有的微生物的种类，其中丰度最高的称为主要微生物，每一个位置中均含有各自特殊的微生物组成。微生物组成的多样性可以分为组内差异（alpha多样性）以及组间多样性（beta多样性）。Alpha多样性是指某一空间内所含有的微生物的种类，而beta多样性反应的是不同空间内所含有微生物种类的差异（Human Microbiome Project C，2012； Huttenhower et al. 2012）。但是本综述关注的不是微生物的多样性，而是微生物本身。目前常见的细菌分类模式就是界、门、纲、目、科、属、种（图1）（Yarza et al. 2014; Pirih and Kunej， 2018）。细菌之间的进化关系成为系统发育，而系统发育通常使用系统发育树来进行表示（Ehrlich，1965）。鉴别菌株的传统方法主要基于细菌中的系统发育或者形态特点，或者特殊的细胞染色特征；目前科研人员主要是基于能够反映种属特点的某些基因（如16SrRNA）的测序或者全基因组学测序技术来实现对菌株的鉴定。
图1 系统进化树
微生物组学分析前的样品制备
在进行微生物组学分析前，首先明确自己的研究目的，然后根据目的采集相应的样品；在采样过程中应该避免交叉污染。因此本章节主要讨论如何进行微生物组学分析样品的制备。
微生物样本的采集
目前市场销售的采样装置主要包括药匙、管子以及配备合适的缓冲溶液。采集人员可以是医学背景出身的专业人员，也可以是非专业人员个体。但是无论采样人员的专业背景如何，采样前都必须清楚采样流程，严格按照采样步骤进行，避免周边环境对样本的污染（比如皮肤、双手、灰尘以及衣物等）。
样品的储藏
由于采样地点与样品分析实验室存在空间上的距离，因此对于大部分样品是无法做到及时处理。针对这种情况，我们可以选择合适的储藏方法对样品进行保藏。最佳的样品储藏方式就是及时将采集的样品置于冰上，然后尽快置于-80摄氏度进行长期保藏（Aagaard et al. 2013; Kim et al. 2017a，2017b； Chu et al. 2018.）。我们需要注意的是样品储藏的缓冲溶液（Salter et al.., 2014）以及样品放置时间的长与短均会影响到最终微生物的组成（Schellenberg et al.， 2017）。
DNA提取以及分离
样品采集后，接着要进行DNA的提取。目前DNA的提取常借助于商业化的DNA提取试剂盒进行。特别需要注意的是试剂盒本身、实验室的设备以及所处的环境均可能污染样本（Salter, et al. 2014; Kim et al. 2017a, 2017b ）。
特别需要注意的是，在采集微生物含量非常少的样品（如精子以及胎粪）时，尽量避免样本的污染，否则会出现假阳性结果。再次，我们强烈推荐使用灭菌的装备，尽力减少样本保留环境中的时间，并且需要采集阴参以及阳参进行对比分析（Salter et al., 2014），以此得出较为准确的结果。
早期微生物组样本的分析过程
显微镜观察
早期，显微镜观察是鉴定微生物（病毒除外）的常用工具。细菌可以通过诸如革兰氏染色以及细胞形态（形状、排列方式以及大小）对菌株进行鉴定以及进行系统分类。目前，临床上仍然会使用显微镜对疑似的病原微生物进行鉴定。在我们人类的生殖健康领域，显微镜仍然被用来分析疑似细菌性引道病的案例（Nugent et al. 1991.）但是由于显微镜观察非常耗时，并且缺乏必要的临床显微镜的培训，目前临床在研发与生殖相关的药物时很少能用到显微镜；此外临床观察方面，已经出现了大量的新的技术也导致了该方法的消失（Bennett et al., 2014）。有研究显示目前临床医生针对细菌性感染的判断已经远远低于PCR或者以探针荧光属性为主的检测（p<0.0001）（Schwebke et al., 2018）。
基于“可培养”技术的方法
“培养”技术是光学显微镜之后出现的第一种方法，该方法通过设计特定的培养基对某些微生物进行培养（Sandle,2011）。基于特殊培养基进行培养后，研究人员会根据细菌不同的染色特性、形态特征以及特殊的化学反应等对菌株进行分类。虽然该方法的成本比较低，但是却非常耗时，并且分析方法十分冗余，此外该方法只能判断可培养的微生物（Nadkarni et al., 2009）。该方法还会因为某些长势较快的微生物会抑制其他某些种的情况导致该方法鉴别出的微生物非常有限（Hiergeist et al., 2015）。因此，单独的培养学的方法只能获得部分微生物的组成，而不能完全全部具有代表性的菌群（Ward et al., 1990）。
微生物测序
基于16S核糖体DNA的测序技术可以很好的客服以上“培养学”方法的弊端。16SrRNA基因在各物种中非常保守，进化过程中未发生很多的变化，因此被用来作为特征性的基因片段进行扩增，然后基于不同菌种序列的特点对微生物进行种属的鉴定（Fig.2）（Lane et al., 1985）。16SrRNA基因总长1500bp，一共包含了9段（V1-V9）高度特异性的片段，这些片段分布在高度保守的片段之间，负责编码原核生物中一个30S大小的核糖体单元（Gray et al., 1984）。设计相应的引物对16SrRNA基因上的保守片段进行PCR可以准确的区分菌株的种属（Větrovský and Baldrian, 2013）。其余的9段高度变异的片段可以用来对菌株进行分类，然后进行进化分析（Woese et al., 1990）。一般而言通过16S测序得到的序列，同源性越高，代表待测菌株的种属与标准菌株的越接近，一般属水平上得高于94.5%，而门水平高于86.5%（Yarza et al., 2014）。1975年，第一代测序技术（Sanger测序）问世，较之传统的以革兰氏染色以及镜检方法，该测序技术在分析微生物多样性方面提供给了具有了更加深入以及更加具体的信息。传统的Sanger测序技术基于对某些冷光的检测，称为焦磷酸测序技术。2005年，下一代测序技术（或者称为高通量测序技术，或者称为第二代16S rRNA测序技术）的问世可以满足大量DNA的同时测序（Metzker, 2005）。在进行分离培养某些种属的菌株之前，可以首先进行第二代测序技术评估一下待分离样品中菌群的组成。商业化的第二代测序技术平台主要八廓Roche Life的454平台（Margulies et al., 2005）以及Illumina的MiSeq以及HiSeq平台（Caporaso et al., 2012; Loman et al., 2012）。但是NDS测序平台测的结果存在比较高的测序错误（Haas et al., 2011）。利用16S rRNA进行测序的关键就是选择合适的引物，引物的好与坏直接关系到测到的序列的准确与否，进而影响到菌株种属的鉴定（Baker et al., 2003; Mizrahi-Man et al., 2013; Tremblay et al., 2015; D’ Amore et al., 2016）。
图2 环形细菌基因组示意图
生物信息学以及可操作分类单元（OUT）的聚类分析
NGS测序会获得海量的数据，为了更好的分析这些数据，目前已经建立了相应的生物信息学分析渠道，该渠道可以将下机测序原始数据转译为可以编译的数据。最常用的分析平台是
Mothur（Schloss et al., 2009）以及QIIME（Caporaso et al., 2010）。该分析平台可以将获得的众多的DNA序列转变为样品中的种属水平（从门到属），协助科研人员分析样品中微生物菌群的组成以及丰度。此外，该平台还可以基于样品中菌群的组成进行相互之间的聚类分析。需要指出的是，分析平台可以将超过97%的相似度的序列归为一个OUT。但是目前由于获得的序列数量越来越多，科研人员针对97%相似度标准提出了异议，认为可以考虑将该标准提高至99%（Edgar，2018）。因此，根据新的标准，这些序列可以进行重新聚类。OUT的构建方法很多（Westcott and Schloss, 2015），比如紧密参照比对的方法，从头拼接方法以及开放式的方法等。紧密参照方法中，获得的序列主要通过与外源开放式的参照数据库进行比对，然后进行聚类，常用的数据库包Greengenes(McDonald et al., 2012), SILVA(Pruesse et al., 2007) 以及Ribosomal Datase Project(Cole et al., 2008).这类分析方式可以同时处理很多组数据，并且还具有分析快速的特点，特别适合于分析大量的数据。未获得比对的序列将在后续分析中被去除。从头测序的方法进行的聚类，不依赖于外在的数据库，而是选择一个参照即可。该方法可以将获得的所有数据进行聚类，但是它不支持不同样品的同时聚类，因此该方法特别耗时，不利于大批量数据的处理。开放式的处理方式结合了以上两种方法的特点，首选将大批量的数据进行紧密参照的比对方法，然后将不能识别的序列进行从头测序的聚类方法。由于使用OUT分析会将基因具有差异性的序列进行了剔除，因此这些数据不能完全反应样品中真实的菌群组成（Chen et al., 2013）。更为重要的是，采用的聚类方法可以直接影响到最终的分析结果（Nguyen et al., 2016）。目前常用的开放式生物信息学分析软件包（比如mothur或者QIIME）已经将所有的分析程序进行了集成，并没有标准化的分析程序，因此导致这种分析方法会得出的菌群组成或者丰度分析过高或者过低，进而不能真实的反映菌群的组成。
全基因组测序
以上分析我们发现，基于16S rRNA 测序技术获得的信息不能真实的反映菌群的组成，为此，科研人员已经成功开发了全基因组测序技术（WGS），该技术既可以对基因进行全基因组测序，更可以对样品中所有的基因进行测序（Ranjan et al., 2016）.WGS技术可以对基因功能进行解析，并且还可以发现新的基因，对可能的代谢通路进行接卸，此外该技术还可以对基因组的结构以及菌群的结构进行分析（Roumpeka et al., 2017）。
IS-pro技术
IS-pro技术是另外一种分析菌群组成的方法，该方法主要基于基因见的空余序列，这些序列的种类以及长度可以很好的反映菌群的组成（Fig.2）(Budding et al., 2010)。
实时定量PCR
在目前众多的测序技术中，实时定量PCR技术已经被证明是一种对目标基因检测灵敏度非常高的技术（Huisdense et al., 2002; Ott et al., 2004）。该方法采用了针对某个特定基因的探针，可以非常特异性的检测该基因转录的变化（Malinen et al., 2003）。
微生物组与疾病健康之间的关系
2008年，美国国立卫生研究院启动了人类微生物组计划（HMP）（Peterson et al., 2009），该计划旨在分析健康人群中五个不同部位的微生物组成（鼻腔、口腔、皮肤、胃肠道以及泌尿生殖道），通过该方法我们试图去找到影响人群健康的特定微生物或者菌群（Turnbagh et al., 2007; Methe et al., 2012。于此同时，欧洲组建了国际微生物组联盟，2008年，人类肠道微生物组的计划得以立项（Qin et al., 2010）, 该项目主要为了分析人类肠道的菌群与健康疾病之间的关系（Li et al., 2014）。HMP计划的初步分析结果显示人与人之间的菌群多样性差距（beta多样性）远比人本身菌群之间的差异性要高（alpha多样性）。此外，研究还发现阴道内的菌群组成的多样性非常低，并且在属水平上的beta多样性非常低，乳杆菌属的含量存在很大的差异（HMP计划，2012）。
宿主与存在的微生物之间存在“共生”的关系，这种相互影响对于宿主保持健康，远离疾病非常有必要（Martin 和Schwab，2012），一旦这种平衡被打破就会诱导出很多相关的疾病（Knight et al., 2017）。目前已经证明微生物组成平衡的打破会诱导龋齿以及细菌性阴道炎。龋齿的产生与普氏菌属丰度的增加有关（Yang et al., 2012; Peterson et al., 2013）。正常阴道内维持较低的pH，并且此时以乳杆菌属为主；而当因为某些因素而导致菌群的多样性增加后会引起阴道内pH的增加，进而引起细菌性的阴道炎（Fredricks et al., 2005）。更为重要的是，目前还发现微生态的平衡还与某些非传染性疾病有关系，比如肥胖、心血管疾病、IBD以及营养不良等。
目前，我们已经发现肠道菌群有助于协助宿主对摄入的食物进行消化，并可以产生维生素护着其他有益的物质，进而有助于提高机体的健康（Flint et al., 2012; Waler and Lawley 2013）。此外，研究还发现环境因子（比如抗生素、膳食、地理位置以及种族等）均可以影响到宿主肠道菌群的组成。（Gill et al., 2006; Cresci 以及Bawden, 2015）.
虽然，目前我们获得了很多关于肠道菌群与健康之间的关系，但是引起肠道菌群平衡至失衡的过程以及因素目前还不得而知。
微生物组与生殖健康以及疾病之间的关系
男性与女性生殖道在解剖机构以及生理结构方面存在很大的差异。男性生殖道包括外在部分（阴茎以及阴囊）和内在部分（睾丸，附睾、副腺以及尿道）。女性生殖道比较复杂，包括阴道、子宫颈以空腔（伸入到输卵管），以及子房附近含有菌毛。
目前生殖道内的菌群是否会向肠道菌群促进人体健康一样影响到宿主的健康还不得而知。但是目前越来越多的证据表明，生殖道内菌群的平衡对于维持宿主的某些健康至关重要。
目前，Chen等人研究发现女性生殖道中存在一种特殊的菌群组成，并且直接证明了有关“生殖道不是完全无菌”的推断。Mitchel等人（2015）研究发现女性子宫内膜上的菌群的丰度远低于阴道中菌群的丰度。因此该研究表明子宫一定程度上可以组织菌群的入侵。未孕的健康女性阴道内肠道菌群存在一个动态变化的过程，菌群的组成主要受到种族、性行为、月经周期以及环境微生物的影响（Zhou et al., 2007; Ravel et al., 2011; Gajer et al., 2012），但是目前公认的是阴道内肠道菌群主要包括四类乳杆菌属，即卷曲杆菌属、Lactobacillus iners, 金氏乳杆菌以及加氏乳杆菌。
在辅助性生殖技术中，阴道内微生物组的丰度由于受孕率之间呈反比关系（Hillier et al., 1995; Moore et al., 2000; Hyman et al., 2012, 2014）。阴道内主要存在乳杆菌属的菌株，该菌群的平衡可以直接影响到受精卵转移的成功与否（Hyman et al., 2012）。具体来说，Hyman等人研究了30个不孕患者在进行不孕疗法后的效果与阴道菌群的关系。结果显示受精卵转移时阴道菌群的组成影响了后期疗法的效果，不孕症治疗成功的病人的阴道菌群与治疗失败的病人中阴道菌群存在明显的差异（p=0.028）。
Pelzer等人的研究结果还显示滤泡液中定制某些微生物可能是导致受孕失败的原因，因为在卵子与精子结合时，滤泡液中定值有微生物可以很明显的提高受精卵的结合率（p<0.0001），降低受精卵的转移成功率（p=0.0001）以及降低受孕率（Pelzer et al., 2013）。该实验的样本采集于263个女性中，来源于两个部位：左右子房（共463份样本）以及阴道内（263份样本）。右侧子房滤泡液中如果出现丙酸杆菌属（p<0.05）以及链球菌属(p<0.01)可能会增加受精卵的转移率，而如果子房内定值的菌群主要是乳杆菌属(p<0.05)可能会增加受精卵的转移效率。
妊娠期间，阴道内菌群的丰度以及多样性菌下降，慢慢转向以乳杆菌为主的菌群特征（Aagaard et al., 2012; Romero et al., 2014; Maclntyre et al., 2015.）Aagaard等人比较了24个怀孕女性以及60个未怀孕女性阴道肠道的菌群特征，结果显示怀孕期间，阴道菌群的多样性以及丰度值菌减少，而在怀孕后期，阴道内菌群的特征又和未怀孕的菌群特征相当。两个独立的人群研究均表明怀孕期间女性阴道内菌群以乳杆菌为主，并且菌群的多样性显著的降低（Maclntyre et al., 2015; Romero et al., 2014）。Maclntyre也研究了产后女性阴道菌群的特征，发现怀孕期间以乳杆菌为主的菌群特征消失，并且alpha多样性增加。研究还发现当女性阴道内菌群以加德纳菌属或者脲原体属为主，或者怀孕期间孕妇阴道内菌群存在不稳定性均会增加早产的风险（DiGiulio et al., 2015; Stout et al., 2017）。怀孕期间，女性阴道内肠道菌群的变化可能与雌激素增加有关（Maclntyre et al., 2015），并且该研究还认为以乳杆菌为主的菌群组成可能会发挥保护阴道健康的作用(Ravel et al., 2011)，以及防止早产的发生(Hyman et al., 2014)。以上研究表明阴道菌群不是一成不变的，而是伴随着某些因素的改变而发生规律化的变化（Forney et al., 2006; Zhou et al., 2007; Kim et al., 2009; Gajer et al., 2012）。
通过分析，笔者认为未来我们应该去探究生殖健康与菌群之间的内在关系：（1）研究菌群的改变是如何引起生殖健康的；（2）如何通过筛选合适的生物标记物来表征生殖健康。但是目前随着测序工具以及生信分析方法的增多，不同的研究结果之间很难做出比对，因此无法通过对这些研究结果进行比对从而找到相应的规律。本文总结了目前发表的有关男性以及女性生殖健康领域的研究结果。
研究方法
图3 数据采集以及分析流程
数据搜索方法
数据来自于Embase, Medline Ovid, Web of Science, Cochrane and Google学术五个数据库。数据搜索的关键词是与生殖健康相关的菌群相关，比如microflora, microbiota, genital tract, reproduction, semen, vagina, uterus, cervical, placenta, conception, assisted reproduction 以及 urogenital microbiome。文献中涉及到的方法已经经过了PROSPERO的审查（2016：CRD42016042506）。
数据筛选的原则
本文所筛选的文章均发表于2005年之后（即二代测序技术问世后），截止于2018年，文章均是英文撰写，并且网上可以下载。所有有效的研究必须于生殖健康有关的菌群研究，此外，我们还针对基于培养以及非培养技术相关的研究也进行了归纳总结。所有的综述文章，以及未发表新的数据，或者我们只能获得摘要的文章统统剔除筛选范围之外，此外，相关的评论性文章以及某些特殊的报告等均不再筛选范围之内。任何针对人体其他部位，而不是针对生殖道内的菌群研究菌剔除筛选范围之内。研究的人群包括男性，怀孕前以及怀孕至妊娠中期的女性。最后，我们关注的文章中至少包含一组健康人群的女性，而我们去除了有关未成年、绝经后期的女性以及携带艾滋病毒、其他患有慢性前列腺炎或者阴道炎的病人。
筛选步骤
我们派出两个研究人员独立自主的按照前述的筛选原则对文章或者摘要进行筛选，以保证我们的筛选文章比较全面。文章筛选结束后，两位研究人员独立的对文章进行进一步的评估，如果对某些研究存在异议，我们选择第三位研究人员进行进一步的评估。
筛选内容
本项目的筛选过程见图表3.本项目共筛选到5201个结果，涉及到2944篇文章。在对文章题目以及摘要进行阅读后，去除了2792篇文章。对剩余文章进行全文浏览后，公共筛选到了51篇文章符合要求。但是由于文章中给出的取样以及生信分析的方法不同，因此未对这些筛选质量进行有效的评估。表格1和表格2总结了文章中涉及到的分析方法以及结果。基于文章中是否使用了“可培养技术”对微生物进行分离和分析，我们又对结果进行了细分。
文章中关于女性生殖道微生物的组成主要涉及到四个部位：阴道、子宫颈、子宫内膜以及上生殖道（包括输卵管、子宫以及腹液水）。男性生殖道内微生物样本的采集主要包括两个部位：精液以及冠状沟。图4给出科水平上生殖道各个部位菌群的组成。本文主要是对未进行筛减的数据进行分析，以期不会因为其他诸如可培养技术是否应用等因素对结果的分析有所倾斜。
结果与讨论
文献报道的菌群组成概述
表1和表2分别给出了男女性生殖道不同解剖部位菌群的组成。根据文章中所使用的菌群分析技术，我们对文章进行了大致的分类。此外，有些文章是对特定的菌群进行分析，有些文章是对全部菌群进行分析，基于这些差异，文章还进行了合理的分类。为了更好的分析生殖道不同部位的菌群分布，我们对各部位门水平上的菌群进行了整理（图 4，图5和图 6）。为了保持数据分析的可信度，我们选择了非特异性菌群结果进行了分析，因为基于16SrRNA或者宏基因组为基础的非特异性菌群分析可以代表整个菌群的分布。
男性整个生殖道中均存在乳杆菌科的菌群；但是结果还显示各个解剖学部位还存在各自特定的菌群（图5 和图6）。女性阴道是其生殖道中最短的部位，主要存在双歧杆菌科、普雷沃氏菌科、韦荣球菌科以及乳杆菌科。此外需要指出的是，乳杆菌科是唯一的一个任何检测技术均可以检测到的菌群。虽然子宫颈通道直接与阴道相连，但是两个部位检测到的菌群差别很大。子宫颈内主要存在的菌群包括梭菌科、粪肠球菌科、葡萄球菌科、链球菌科以及乳杆菌科。但是当我们基于不同的检测技术对上述结果进行整理时，我们发现阴道以及子宫颈内菌群的分布相似。基于可培养技术分析得到的结论是阴道和子宫颈内的菌群主要以粪肠球菌科、葡萄球菌科以及链球菌科为主，而以测序技术分析得到的结论是阴道以及子宫颈的菌群主要以乳杆菌科以及普雷沃氏菌科为主。换句话说，不同的文章采用相同的方法会得到相似的菌群组成。
子宫腔以及子宫内膜内的菌群主要以链球菌科以及乳杆菌科为主。这两种科的菌在阴道以及子宫颈部位全部可以检测到，虽然我们做了很多防护措施，目前还不能完全排除样品发生交叉污染的可能性。为了进一步的检测子宫颈、子宫腔以及子宫内膜的样品是否会收到阴道样品的污染，我们比较了不同的研究（Fotouh and Al-Inany,2008; Cicinelli et al., 2014a; Wee et al., 2017; Taylor et al., 2018）。但是目前还无法得出比较统一的结论。Wee 等人（2017）指出阴道、子宫颈以及子宫内膜内菌群的种类是一致的，但是不同菌群之间的比例是不同的。但是Cicinelli 等热（2012）指出子宫颈内的菌群与子宫内膜上的菌群组成相似度很低。
在本综述中我们发现使用可培养技术分析菌群组成时，子宫以及子宫内膜的菌群结果没有任何统一的结论展示。因此我们认为，单纯的可培养技术是无法分析子宫内腔内菌群的组成。在使用测序技术分析菌群组成时，我们发现很多报道均指出子宫腔内含有乳杆菌科、双歧杆菌科、丛毛单孢菌科以及链球菌科，因此我门认为在进行子宫内菌群分析时，基因组的测序技术更为合适。基于以上分析，我们认为子宫国内应该存在特有的菌群，因为从目前的结果分析我们发现除了乳杆菌科之外，没有任何一种科的菌在阴道以及子宫颈样品作为一种主要的菌群被检测到。
在女性上生殖道中，主要存在乳杆菌科、消化链球菌科以及丙酸杆菌科，其中两面两种菌还未在生殖道其他部位被检测到。
男性生殖道内样品采集更加困难，并且很容易造成样品污染。目前精液中的菌群研究最为系统，结果显示精液中主要含有的菌群未葡萄球菌科菌、链球菌科、粪肠球菌科以及粪肠杆菌科以及乳杆菌科。综述的文章中关于精液菌群组成的报道与作者本人课题组的结果是一致的。相比较而言，冠状沟处的样品更容易采集，结果显示该部位主要含的菌群为紫单胞菌科以及普雷沃氏菌科。以上结果显示，与女性生殖道类似的是，男性生殖道不同部位的菌群也存在特异性。
图4 文献报道的生殖道中常见的微生物种属
图5 生殖道不同部位科水平上菌群的分布
图6 每个解剖区域和样本中在科水平上表示细菌是否存在的热图
研究生殖道健康的临床意义
阴道是连接外界环境以及女性生殖道内部环境的纽带，因此该部位很容易受到外界环境以及内部环境的影响。阴道内的微生物可以有效的保护该部位不受其他因素的影响。以上文章的结果显示，阴道内主要含有乳杆菌科的菌群，可能发挥保护阴道不受其他病原菌侵染的作用。由于乳杆菌可以产乳酸（Gajer et al., 2012），因此研究人员认为，乳酸可以保持阴道内较低的pH环境，进而可以阻碍病原微生物的侵染(Alakomi et al., 2000; O’Hanlon et al., O’Hanlon et al., 2013)。女性阴道内pH之间的差异可能是导致其内部菌群差异的重要原因（et al., 2012）。除了乳酸之外，乳杆菌产生的细菌素可能也是其发挥保护阴道健康的原因（Mendes-Soares et al., 2014; Ojala et al., 2014）。此外，乳杆菌还可以合成D-型和L型的乳酸，对于阴道也可以起到保护作用，需要注意的是人类本身只能合成L型的乳酸（Mendes-Soares et al., 2014）。D型乳酸最大的特点就是可以下调基质金属蛋白酶8（MMP-8）的表达，从而保持子宫颈栓的完整性以阻止阴道内的菌群的入侵（Witkin et al., 2013）。此外，研究还发现乳杆菌可以结合在阴道的粘膜层，从而阻止了其他致病菌的结合，进而保证了阴道的健康（Mendes-Soares et al., 2014; Ojala et al., 2014）。
基于16rRNA测序结果，我们可以将阴道内菌群分为五种群体，即CSTI-V（Ravel et al., 2011），其中四种群体中均以乳杆菌为主。第I类群体以卷曲乳杆菌为主（占比26.2%），第II类以加氏乳杆菌为主（占比6.3%），第III类以Lactobacillus iners为主（占比34.1%），第V类以詹氏乳杆菌为主（占比5.3%）。第IV类并不以乳杆菌为主，而是以更为严格厌氧的菌株为主（Ravel et al., 2011）。CST IV-A类主要以乳杆菌属以及另外其他一些严格厌氧的菌株为主，而IV-B类主要以Atopium, Prevotella, Sneathia 以及Gardnerella为主（Gajer et al., 2012）。雌性激素的分泌可能是导致人群中阴道菌群差异性很明显的原因之一，因此乳杆菌的生长是依赖于雌性激素（Bezirtzoglou et al., 2008）。
研究显示阴道内菌群是处于动态变化的，种群类别也会随之会发现转变（Gajer et al., 2012）。但是，种群种类之间的转换并不是平等的。比如IV-B类型通常转变为III型，很少转变为I型；I型经常转变为III型或者IV-A型；III转变为IV-B的概率是转变为IV-B的两倍；II型很少转变，目前还未发现I型菌群转变未II型。一个16周的观察表明相对IV-A型，II类型的菌群非常稳固。基于以上分析，对女性阴道菌群的研究不能限于某点处的分析，因为某一点处的结果是无法满足菌群动态变化的规律。自然状态下大部分的阴道菌群的改变是非常短暂的，只有35%的菌群类型可以维持小于1周的时间。阴道菌群的转换会受到月经以及性行为的影响（Gajer et al., 2012）。
种族之间的差异也会造成女性生殖道内菌群种类的差异。Anahtar等人（Anahtar et al., 2015）的研究结果表明南非妇女子宫颈处阴道中乳杆菌占比37%，加德纳菌属占比45%，其中乳杆菌的比例远低于其他文献报道的比例（白人女性，90%；黑人女性62%）（Ravel et al., 2011; Zhou et al., 2007）。虽然种群差异存在很大的不同，但是Anukam (Anukam et al., 2006) 以及Pendharkar （Pendharkar et al., 2013）等人的实验结果表明，非洲以及白种人种乳杆菌的种属是一致的。
阴道炎
阴道炎会引起女性阴道内有异样液体流出，有异味产生，并且伴随着瘙痒。阴道炎主要包括三类：细菌性阴道炎、念珠菌阴道炎以及滴虫引起的阴道炎（Sobel, 1997），当女性罹患阴道炎时常常会伴随着诸如拟杆菌属、动弯杆菌属、念珠菌属以及阴道毛滴虫的过度生长。一般可以通过临床症状以及镜检的方式对阴道炎进行确诊。临床检测方法主要依靠Amsel（Amsel et al., 1983）以及Nugent(Nugent et al., 1991)建立的一套完整的科学方法。细菌性阴道炎时目前最为普遍的一种阴道性验证，主要是由于多种属微生物菌群失衡所致，有报道称，30%的妇女在生育期间会罹患细菌性阴道炎（Workowski 以及 Bolan, 2015）。细菌性阴道炎一般是由加德纳菌属、奇异菌属、动弯杆菌属、支原体、小类杆菌属、Sneathia以及丙酸杆菌属等的紊乱造成（Onderdonk et al., 2016; Liu et al., 2013a,b）。阴道炎会导致阴道内菌群多样性增加（Gottschick et al., 2017），从而导致其内部pH升高（Brooks et al., 2017）。需要特别注意的是，阴道炎会造成不孕不育、流产、复发性流产等（Isik et al., 2016）以及早产（Onderdonk et al., 2016）。临床以及镜检等方式对阴道炎的诊断对于评估、预测以及治疗阴道炎具有很多临床上的意义。监测芽殖酵母或者利用光学显微镜检测假丝酵母等可以用来诊断念珠菌阴道炎（Workowski 以及Bolan, 2015）。滴虫引起的阴道炎可以通过镜检、培养、生化指标（如抗原、核酸杂交以及核酸扩增等）进行检测（Prevention, 2015;Workowski and Bolan, 2015）。尽管上述的很多微生物可以通过普通光学显微镜可以观察到，但是目前缺少非常有经验的临床镜检员，因此我们期待未来二代测序技术可以在诊断阴道炎方面发挥更大的作用。
不孕不育以及辅助生殖技术
生殖道内的微生物组与自然受孕以及辅助生殖技术的成功与否有很强的联系。生育问题多是由于女性生殖道内微生物组发生不良变化引起（Schoenmakers et al., 2018），最终导致生殖道内菌群的失衡。乳杆菌可以产生乳酸、细菌素以及过氧化氢（Petrova et al., 2015）等物质，这类物质可以有效的抑制某些致病微生物的生长，为受精卵的正常生长提供良好的环境。
与健康女性相比，罹患不孕不育症的患者子宫颈内乳杆菌大幅度的减少（Graspeuntner et al., 2018）,阴道内惰性乳杆菌的丰度值偏低，而念珠菌属的丰度值增加，这类患者普遍患有阴道炎，并且还存在很多特殊的菌株，比如Atopobium vaginae, Ureaplasma vaginae, Ureaplasma parvum, Ureaplasma urealyticum 以及加德纳菌属，此外Mycoplasmateceae的丰度值偏低（Costoya et al., 2012; Urszula et al., 2014; Panda et al., 2016; Babu et al., 2017; Campisciano et al., 2017; Wee et al., 2017）。此外，细菌性感染引起的不孕症患者子宫颈内菌群的多样性会增加，并且伴随着乳杆菌的丰度值降低，子宫颈内加德纳菌属、丙酸杆菌属、Leptotrichia amnionii以及Sneathia的丰度值会增加（Di et al., 2018; Graspeuntner et al., 2018）。此外，还有一些结果也证实了乳杆菌在保护女性生殖道健康过程种的作用（Moreno et al., 2016）。此外，研究还发现，当子宫内膜流体种出现加德纳菌属（隶属于双歧杆菌科）以及链球菌（隶属于链球菌科）时，受精卵的正常生长、妊娠以及新生婴儿成活率均受到负面的影响（Moreno et al., 2016）。成功生育婴儿的妇女阴道内菌群的多样性要低于未成功生育妇女阴道内的菌群多样性，并且由于乳杆菌在阴道内是主要菌株，也提升了正常生育婴儿的概率（Hyman et al., 2014）。但是Fotouch 及AI-Inany（2008）以及Franasiak 等人 (2016)的研究结果显示子宫颈管以及子宫内膜内菌群的组成在促进受孕率方面的作用不明显。Cicinelli 等人的研究结果显示子宫内膜上的某些特殊的菌群额能会导致子宫内膜炎（Cicinelli et al., 2014a,b），进而会增加未成功受孕（Khan et al., 2014）、受精卵未转移（Cicinelli et al., 2014a,b）以及出现连续性流产（Cicinelli et al., 2014a,b）的风险。但是，有结果显示人为的增加女性生殖道种条件致病菌可能会降低乳杆菌的丰度（Aleshkin et al., 2006），并且还会降低辅助生殖治疗的成功率。
精液微生物菌群与生殖道健康
除了上述方式之外，精液是另外一种可以将外源的菌群带入女性生殖道内。表2显示精液种是存在菌群的，很可能是男性生殖道菌群的混合物。二代测序结果显示精液种的菌群主要包括三类，即乳杆菌、假单胞菌以及丙酸杆菌。结果显示，80%的精液样品的菌群主要以乳杆菌为主（Weng et al., 2014）。还有研究显示精液中不仅仅定植有专属于自身的菌，很多菌在射精前可能黏附于精子上（Toth et al., 1982; Svenstrup et al., 2003; Keith and Berger,1985），这里菌株还因此可以转移到女性生殖道中。当精液中存在支原体时，可能会因此导致精液中精子的浓度比较低，并且还因此导致精子的形态不正常。Ahmadi等人的研究结果显示患有不孕症男性患者体内精液中人型支原体出现的频率明显高于正常男性的，此外抗生素的处理可以提高精液中精子的质量。与女性生殖道类似，患有生殖疾病的男性生殖道内乳杆菌的含量比较低，而菌群的多样性更高（Mändar et al., 2017）。当精液中奈瑟氏菌属、克雷伯氏菌以及假单胞菌属的丰度增加，而乳杆菌的丰度值降低均会导致精液的粘度异常增高，并且会增加少弱畸精子症的发病概率。，该结果表明性传播疾病会同时导致男性以及女性的生殖疾病的发生。
男女性生殖道菌群之间的相互作用
以上我们分别讨论了男女性生殖道内菌群的特征，但是我们不得不面对的现实是二者之间的菌群不可避免的会受到对方的影响，并且似乎还可以发挥相互作用。
Mandar等人比较了精液以及阴道中菌群的分布，实验结果表明二者中有很多基因DNA是共享的，并且还有大约85%的菌属类型是一致的。其中这些菌属主要为乳杆菌、韦永氏球菌属、链球菌属、卟啉单胞菌属以及奇异菌属。尽管精液中菌群的多样性更高，但是相对阴道菌群而言，其浓度较低。
图7 妊娠前后生殖道微生物的组成
精液的微生物菌群可以非常显著的影响到阴道中的菌群，但是该影响一般是短暂的（Borovkova et al., 2011）。性交可以导致阴道内pH的升高，比如Nugent评分显著性的提高，此外，特征性组成也发生了改变，导致葡萄球菌以及链球菌等种属的丰度增加。而当Nugent评分比较低时，上述特征菌群发生改变的可能性降低，也从侧面反映出乳杆菌产生的某些酸维持阴道内较低的pH对阴道而言具有保护作用。但是Eschenbach等人的研究结果显示性交8-12h后阴道内乳杆菌以及pH未发生较大的变化，但是阴道内大肠杆菌的丰度值显著的增加。Leppaluoto等人的研究结果显示射精后，由于精液等的中和作用导致阴道内乳杆菌被加德纳菌属取代称为优势菌群。很多实验结果显示，在啮齿动物中，长时间的暴露在精液中会导致阴道内某些信号通路的改变，进而导致子宫内膜的接受能力以及受精卵的生长受到恨到的影响。我们推测如果人类也会存在这种现象，那么也很有必要进行该研究（Robertson and Sharkey，2016）。
但是，目前，男女性生殖道内微生物群落时如何发挥相互作用还不得而知。并且未来我们需要去了解是否性交过程中男女性生殖道内微生物群落时间会发挥相互作用，并且这种相互作用是否会延至受精卵的生长进而保证正常的妊娠反映？
未来关于微生物组学的思考
可比性
本综述显示目前不同机构在分析微生物组结果时采用的测序手段以及分析技术时不同的，因此很难对不同的结果进行有效的比较。另外，越来越多的结果显示不同种族的个体之间微生物组成存在很大的区别。最后，目前的结果似乎显示患有生殖疾病的女性微生物组成与健康女性之间微生物的组成存在很明显的差异。但是还没有一个统一的标准可以对这些结果进行有效的比较。正因为如此，我们很难将现有的关于女性或者男性个体之间，或者男女性之间，健康人群以及患病人群之间，或者受到某种干预的群体之间的研究结果扩展到更大的患有不孕症的患者体内，也就是说目前还不能基于目前的结果得到一个更为广泛的被认可的规律。在该综述中，我们对目前所有的文献结果进行了整理和归纳，目前我们获得了关于男女生殖道内各部位菌群的结果。但是，目前还急需将各菌群的结果与人体的健康状况以及治疗效果进行关联分析。处理人与人之间的差别之外，个人之间菌群的结果也存在很多偶然性，因为很多研究只对研究对象进行了一次的取样。但是不同时间的取样又造成了时序上的差异。未来，我们需要将Jensen-Shannon差异指数引入研究中对目前的差异性进行定量分析。另外，我们还需要采用准确的聚类方法，对患者以及阴性对照的结果进行有效的分析，以期减少样本之间的差异。
动态分析
微生物最初的研究主要时针对菌群多样性的研究，目前该领域研究的重点就是分析哪些因素可以导致菌群组成发生变化，比如包皮切割术（Liu et al., 2013a,b）以及经期等（Johnson et al., 1985）。纵向的分析结果显示阴道内的菌群时在动态变化的。很多内部以及外部因素均可以导致阴道内菌群的多样性以及丰度值发生很明显的变化。从目前的结果分析，我们可以认为生殖道内菌群的改变会受到很多性交方式的影响（Schwebke et al., 1999）。基于以上研究结果，我们可以通过将目前菌群不平衡的状况调整到平衡的状态，进而可以提高生殖结果。
功能
为了更好去分析菌群与健康状况之间的关系，并且去研究是否可以通过调节减少某些疾病的发生，我们首先需要去了解微生物菌群的组成以及功能。我们的终极目标是为了分析男女性生殖道菌群的组成，并且去分析哪些因素可以促使菌群向有益身体健康的方向转移。未来我们可以通过代谢组学的方式去分析菌株种属之间以及宿主-菌株之间的相互关系。
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