科研 | 在极高浓度二氧化碳下土壤的碳转换过程及微生物组的变化
本文由郭修诚编译，董小橙、江舜尧编辑。
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高浓度CO2对土壤生物群落的影响目前知之甚少。我们研究了一个泛洪平原湿地，此地的温带火山二氧化碳(mofettes)的长期排放与来自地幔的碳积累有关。通过使用同位素地球化学，土壤活性测量和多组学分析的综合方法，我们证实了高（几乎纯）的二氧化碳浓度强烈影响碳生成和分解的途径，从而影响碳转换过程。特别是，与暴露于正常二氧化碳水平的对照湿地土壤相比，促进暗二氧化碳固定显著增加了mofettes中的地质碳输入。放射性碳分析表明，mofettes土壤中大量碳来源于植物初级生产和地下固碳对地质源CO2的同化(高达67%)。然而，几乎未降解的有机质的保存和积累似乎是由于中观-宏观真核生物的永久排斥和相关的物理和/或生态特征得到促进的，而不是土壤有机物分解的生化潜力受损的原因。我们的研究表明，CO2诱导的土壤群落多样性和功能的变化能够形成不同寻常的生物地球化学特征。
论文ID
原名：Altered carbon turnover processes and microbiomes in soils under long-term extremely high CO2exposure
译名：长期暴露在极高浓度的二氧化碳下土壤碳转换过程及微生物组的变化
期刊：NAT MICROBIOL
IF：14.174
发表时间：2016.1.27
通信作者：Kirsten Küsel
通信作者单位：水生地质微生物学，生态研究所，耶拿大学，德国
实验内容
背景
碳酸喷气孔(Mofettes,下同)是低温（<100°C）的喷气孔，可将几乎纯净的火山CO2排放到大气中。这些陆地排气点可能释放>0.5 tCO2d-1，导致土壤CO2气相浓度(>90 vol%)持续升高，这可能与光合作用进化时期的地球大气相似。极高浓度二氧化碳对土壤生物群的直接和间接影响还没有得到充分的研究，但对地下注入后二氧化碳泄漏的环境后果进行评估或碳捕获和储存，更好的理解具有重要意义。由于在未受影响的参考位点附近通常具有强烈的局部通风，因此与那些在氧化还原条件下发生波动的地点相比，mofettes的研究还可以扩大我们对长期稳定缺氧条件下形成的土壤食物网中微生物相互作用的知识。
根据CO2暴露的时间和程度，mofettes显示出明显的地球化学特征，具有还原性和酸性土壤的特征。例如，较低的pH和氧化还原条件显着影响金属（非金属）动态，从而可能影响土壤养分的可用性。特别感兴趣的是mofettes中碳的周转和储存，因为这些因素通常与土壤有机质（SOM）的积累有关，土壤有机质（SOM）似乎随着深度和p（CO2）而增加。目前尚不清楚这种积累是否是由于全面转向地下C输入增加和/或C矿化减少的结果。有趣的是，最近在泛洪平原湿地mofettes的一项研究表明，额外的C输入可能是由厌氧二氧化碳利用原核生物（例如产乙酸菌和产甲烷菌）进行的微生物驱动的地下二氧化碳同化造成的。这些原核生物也已知是SOM的复杂厌氧分解过程中的重要终端成员，其在连续发酵，互养，产乙酸和/或产甲烷步骤的分解代谢网络中转化，与氧依赖性SOM转换相反。
长期二氧化碳排放的直接或间接影响也可能损害整体土壤活动或特定的SOM降解过程，如缺氧条件。SOM的降解通常依赖于土壤生物群的物理和生化能力，并由生物和非生物控制下的大量木质素和碳水化合物代谢酶介导，我们预期这些酶会被CO2脱气显著改变。几十年来，评估土壤群落的代谢潜力和活动作为C循环变化的驱动因素一直是生态研究的焦点，但在很大程度上仍然是一个挑战。随着“宏组学”方法在土壤生态学中的应用，现在可以将种群，活性和微生物相互作用与当前对生态系统功能的感知联系起来，如C的生物地球化学循环。迄今为止，只有少数土壤研究利用了环境转录组学的综合酶活性信息潜力。突出的例子是高北极泥炭，永久冻土和岩溶沼泽的调查。这些研究表明，“组学”数据可以与关键过程的实际速率相关联，因此可能有助于阐明复杂土壤生化网络的变化。
我们采用多管齐下的综合方法，将深度分辨同位素地球化学和土壤活动分析与转录组学和宏基因组学相结合，以确定在长期高CO2暴露下改变土壤中C转换的过程。我们表明，mofettes C矿化和固定可能受到CO2诱导的土壤食物网营养水平内和多种多样性和功能变化的影响，这可以解释不寻常的mofettes土壤C模式。
结果与讨论
碳酸喷气孔土壤中火山C的积累
该研究湿地的碳酸喷气孔土壤（50°08'48.4”N，12°27'04.5”E;）在各个深度持续缺氧，有着稳定的低氧化还原条件。由于向上流动的地球成因气体(>99 vol% CO2)的影响，它被归类为具有明显还原性特征的组织溶胶(还原Y层;图1a)。相比之下，泛洪平原湿地对照土壤，被归类为潜育性冲积土壤，具有与地下水位波动的有氧/缺氧过渡，伴随着更深处的氧化还原电位的降低。释放的CO2接近饱和的溶解仅引起轻微的孔隙水酸化（ΔpH≈0.6），这可能是由于SOM中不同官能团的缓冲。
（图1 碳酸喷气孔和对照组非根际土壤的地球化学特征）
Mofettes中的总有机碳（TOC）含量随着深度从22.0增加到47.3 wt％（图1a）而对照土壤中TOC含量中随着深度从22.9降低到3.7 wt％。放射性碳（14C，以pMC为单位）随参考土壤（图1b）的深度从95.14 pMC（0-5 cm）降至72.31 pMC（40-50 cm），这对于该区域土壤来说是典型的。相比之下，在各个深度，Mofetts非根际土壤的放射性碳（Δ14C活性= 37.63±8.04 pMC）始终较少，这表明SOM的主要部分（54-67％'死'的C）来自生物同化的非14C的火山CO2。如对照土壤剖面中所观察到的，14C随深度没有剧烈下降，这表明火山源的CO2即使在地表也是能够被固定的。这通过放射性碳分析得以证实，Mofettes中22.3 pMC的14C含量是mofette凋落物，而植物生长为19.38 pMC。与对照土壤相比，mofettes非根际土壤中的稳定C同位素在13C中富集较高，这与使用“较重”的地质CO2源比大气CO2（Δδ13C≈+ 6‰）一致。δ13C随深度的降低（图1c）与mofette中的C含量呈负相关，亦表明SOM成分向13C耗尽的化合物（如木质素，脂质及其降解产物）的变化，和/或具有影响高C同位素分离的过程，例如产甲烷或乙酸发生。
在这两种土壤中，枯枝落叶层下面的C的粒径很小（<0.05mm）表明了至少部分良好分解的有机质。然而，在沿着mofettes土壤剖面的肉眼观察中也发现了一些完整的植物结构。Mofettes中的C/N比从表面附近的16随深度增加到了40，但在对照土壤中随深度保持相当稳定（15±2）。热重分析（TGA，图1a）揭示了土壤中热不稳定（例如，多糖），顽固/难熔（例如脂质）和惰性/烧焦化合物的量的相反趋势。整个mofettes中较多的不稳定化合物贯穿其间，其不稳定组分与顽固组分的比例稳定在1.4±0.1，这一比例在标准土壤中从2.1（0-5 cm）下降到1.0（> 20 cm）。再结合与此形成鲜明对比的14C，δ13C和C/N模型，这表明对照土壤中存在着有效矿化，而在mofettes相对较少降解和旧的有机物质得以保存（即，由植物和/或微生物固定的地质C）。在较长时间尺度下的低pH和氧化还原电位导致了金属（非金属）从主要矿物相解吸和溶解，因此短期有序矿物（例如水铁矿）不太可能解释C稳定化。
（图2 实验组（Mof）和对照组（Ref）在环境转录组学中注释为CRAZY分类的转录本的频率谱）
SOM分解的遗传和转录蓝图
我们通过转录组学和宏基因组学的方法研究了mofettes和对照区域中在较浅水深（0-10厘米）和地下水位（25-40厘米）的土壤，特别关注了SOM分解的生化潜力。土壤酶系统受生物和非生物因素的强烈控制，因此被认为其对二氧化碳水平，地球化学和底物（即SOM）数量和组成的变化较为敏感。尽管在mofettes和对照土壤中这些参数存在差异，但所有样品中单个CAZY（碳水化合物活性酶数据库）类别具有相似的频次分布图（图2），表明碳水化合物代谢酶合成和分布的调节基本上不受极端二氧化碳排放的影响。真核生物，特别是真菌，通常被认为在新鲜的凋落物降解中比细菌更重要。虽然真核起源的CAZY转录本在0-10cm参考样品中十分丰富（高达7％），但mofettes和对照土壤中的分解过程似乎主要由细菌来源的酶介导，尤其是酸杆菌（高达32％）。然而，这也可能因参考CAZY数据库中细菌基因组的过量表达或我们数据集中未鉴定的转录本部分（质量过滤序列的19±13％;）而有所偏差。CAZY转录物的分类谱与发酵相关的丰富多样性和相似性进一步表明群落范围参与厌氧SOM降解。
（图3 概述模型总结了极高CO2浓度对主要湿地泛洪平原土壤酶功能和土壤食物网多样性的影响，基于环境转录组学和宏基因组的推断）
转录活性和实际酶活性水平可能是分离的。例如，与碳水化合物活性酶（CAZY相关的AA类）协同合作的氧化还原酶，如木质素分解酶，可以在mofette是中的缺氧条件下被抑制。事实上，酶介导的活化和随后木质纤维素分解产物的保留相结合将为在mofette中随深度C含量增加这一不寻常的模式提供可行的解释（图1）。木质素化合物的矿化也可以在缺氧条件下进行。然而，凋落物生物质中碳水化合物优先转化会导致木质素-半纤维素网络的部分分解和随后的溶解。在酸性条件下，如在mofettes中，木质素表面电荷中和（主要通过H+）促进聚集并最终沉淀。
火山CO2排放对C和能量代谢主要途径的影响
向上的二氧化碳所形成的稳定的低氧化还原条件似乎能够实现严格的厌氧过程，即使在土壤表面附近的浅层也是如此（图3a）。例如，我们发现与产甲烷（mcr）和硫酸盐还原（dsr，cys，apr）相关的转录本频率显着增加，但与对照相比，与有氧呼吸（cox）相关的转录本频率较低。反硝化步骤（nar，nir，nor，nos）的关键转录本在mofette中的频率也较低。转录物频率的相对增加通常也反映在推定的表达水平（RNA / DNA）的增加中，尤其是对于mcr转录物。与CAZY频率分布类似，在mofette和对照之间没有检测到单个SEED发酵子系统的转录本丰度的主要差异，这表明在群落规模上，发酵C转换在很大程度上不受高p（CO2）的影响。
与mofette中SOM地质特征一致，我们检测到自养卡尔文循环和还原性乙酰辅酶A途径的关键酶的高频率转录物。后者存在于产乙酸菌和非产乙酸菌中，例如产甲烷菌和硫酸盐还原剂，并且所涉及的酶分别以合成代谢或分解代谢的形式用于CO2还原或乙酸盐氧化。关键酶复合物CO脱氢酶/乙酰辅酶A合成酶（由cdh / acs编码）的转录主要与梭状芽孢杆菌（厚壁菌门门;高达33％）相关，其中含有多种产乙酸菌，产甲烷性甲烷微生物菌群（广古菌门;高达27％）和可能有硫酸盐还原或同生型的杆菌目（Δ-变形菌门;高达34％）。在mofettes中的卡尔文循环的关键酶核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶的转录物主要与绿藻和硅藻（藻绿藻和原生藻菌;高达60％的rbc转录物）相关，并且表现出比对照土壤高四倍的潜在表达水平（RNA / DNA），其中没有检测到藻类相关的rbc转录物。在缺氧和非光合营养条件下，藻类可能通过线粒体呼吸或发酵产生ATP，这种能量可以通过卡尔文循环促进CO2同化。在大气CO2浓度下，大多数藻类依靠能量密集的CO2浓缩机制来应对二磷酸核酮糖羧化酶活性位点的O2和CO2之间的竞争。因此，mofette中适应了的藻类和其他自养生物可能从高CO2浓度中获益。
（图4 实验组和对照组培育土壤固定和形成CO2的速率）
火山CO2排放对土壤多样性和功能的影响
小亚基rRNA序列(SSU核糖核酸标记)的三域分类图谱显示，细菌核糖标记在所有元转录组中所占比例最高(83-91%;)。在mofettes中发现大多数古菌核糖标签（高达6％）是在25-40cm的深度，而在对照土壤的0-10cm处中发现大多数真核核糖体标签（高达16％）。16S rRNA基因拷贝数随着深度的增加而略有下降，并且两种土壤中细菌总体上相似（~109至1010个基因（g（dw））-1;）；Mofette中古细菌（> 109个基因（g（dw））-1）中略高于对比土壤（~108至109基因（g（dw））-1）。这表明我们的转录组和宏基因数据中观察到的相对变化可以代表向更专业化的官能团的转变，而不是总生物量的增加。
Shannon和ACE（基于丰度的覆盖度估计）丰富度指数表明，mofette中的系统发育多样性实质上低于对照土壤。这也反映在一般功能基因和转录物的丰富程度显着降低，但不是碳分解。在转录组和红基因组中发现mofette和对照土壤之间功能丰富度的差异，表明极端CO2暴露对一般代谢功能有中长期多样性影响，并且这些差异在土壤表面附近的浅层深度最高。作为中宏观生物功能特征的一种潜在模拟物，由高浓度二氧化碳引起的代谢复杂性的降低可能与土壤生物群落中促进相互作用的减少有关。
作为湿地的典型特征，对照土壤真核生物群落具有较高的多样性，以动物为代表（动物界，高达25％，主要是环节动物门和环节亚门），植物（链形植物，高达13％），不同的原生生物（高达24％; 包括囊泡虫总门 ，根瘤菌和变形虫）和真菌（高达47％;子囊菌，担子菌和球囊菌门）（图3b）。与之相比，高比例的藻类（高达60％;主要是绿藻门内的共球藻纲，以及不等鞭毛类内的金藻和硅藻）与子囊菌一起主导了mofette土壤中的真核生物。它们的存在，特别是在较深层，可能表明厌氧和异养生活方式，因为一些藻类可以耐受高达约100％的二氧化碳。长期暴露于改变的环境条件可能使其富集，同时可能产生表型异质性甚至侵入适应的物种。相比之下，属于较高营养水平的生物（动物和原生生物），假定的菌根真菌和植物的具有较低的频率表明，与这些生物的活性相关的关键土壤食物网相互作用和功能可能缺失或严重受损。这些包括物理特征（例如，枯枝落叶分解和可达性）和生态特征（例如，捕食，来自菌根协同的共生益处），能够允许有效的SOM分解，因此可以解释较少退化的有机物质得以保存的原因。
土壤和各个深度上细菌群落的组成纲水平上非常相似，这表明它们很好地适应pH和氧化还原条件的变化，例如，由于CO2排放或波动的水位。大多数核糖标签属于细分1酸杆菌门（25-43％），其次是Δ变形菌门（13-21％）。特别是酸杆菌门由于其丰富的酶降解复杂有机物质的能力而被认为参与SOM降解。大多数Δ变形菌门属于mofettes中硫酸盐还原菌或同养菌科(高达13%)，或者对照土壤中属于可移动和微掠食性黏菌(高达16%)。mofettes的古菌核糖标签主要由使用甲烷曲霉的H2-CO2和使用甲烷微生物的甲烷乙酸盐（21-47％）以及MCG的厌氧和异养成员（Miscellaneous Crenarchaeotal Group，33-43％）所主导。
土壤碳储存的地下二氧化碳利用的重要性
由于增加CO2利用的分子证据和mofette SOM中强烈的地质特征(图1)，我们在接近原位CO2浓度(对照中为5% vol%，mofette中为100% vol%)的13CO2标记培养中测试了暗CO2固定的深度分辨电位（图4）。Mogette中暗二氧化碳固定总体比对照土壤高1.5~3倍,两者都随着土壤深度减少。假设土壤容重为1 g/cm3并且观察到每个深度间隔的掺入率保持不变，微生物能够在mofette中固定0.29±0.07 g C m2d-1，在对照土壤中固定0.13±0.05 g C m2d-1。与在苔藓主导的湿地中典型的~0.3-12 g C m2d-1的初级产量相比，暗CO2固定可以贡献相当大比例的土壤C输入，特别是在土壤表面附近。使用比较放射性碳和稳定碳同位素比分析进行的详细的后续调查证实了地下二氧化碳同化的重要性，估计微生物在微生物的SOM中对地质C输入的贡献高达~27％。
我们还测试了CO2浓度（5,20,50和100 vol％）对暗CO2固定的影响。即使在对照土壤，暗二氧化碳固定增加1.4 - 2倍，从5到50 vol% (图2 b)，这展示了在土壤生物应对短期(≤14天)气体组分变化的能力。此外，与Michaelis-Menten动力学的有趣相似性表明存在酶限制，即底物浓度和饱和度。这为接近原位CO2浓度的土壤不同深度暗CO2固定的差异提供了可行的解释（图2a）。高CO2浓度（> 5 vol％）对土壤中CO2利用的重要性一般被忽视。考虑常规p（CO2）在土壤孔隙空间存在几个数量级(∼10 vol%)的变异性,例如出现较差的曝气环境,我们在其他土壤C循环中也观察到定量输入的相关性。
为了将暗色CO2固定增加与分解释放的CO2联系起来，我们对mofette和对照土壤进行了深度分辨缺氧和有氧氧培育研究(图2c)。二氧化碳的产量至少是暗固定二氧化碳的5.7倍，这表明仅暗二氧化碳固定不足以维持mofette C，而“火山”土壤C的大部分来自植物凋落物的输入。此外，在Mofettes的所有深度都较对照土壤高一些。胞外酶活性(β-葡萄糖苷酶，纤维二糖苷酶和一般水解酶活性)也表明与对照土壤相比，mofette中活性较高，与宏转录组和宏基因组数据一致，进一步表明mofettes中SOM矿化的生化潜能未受损。此时值得注意的是，尽管mofette地球化学与转录活性之间存在整体一致性，但仍需要进一步研究原位条件下的实际酶活性，因为终产物抑制可能在高CO2浓度下变得相关。
结论
本研究的mofette呈现了一个独特而极端的土壤环境，其中包含了适应长期高二氧化碳暴露的各种微生物群。能够利用二氧化碳的厌氧菌和藻类似乎从这些条件中获益，并不断将从地幔发出的二氧化碳引入土壤C循环。暴露在二氧化碳环境不仅影响土壤多样性，而且影响食物网结构，也排除了较高的营养水平和相关的物理和生态特征等因素，因而保护了古老的(地球成因的)、较少降解的有机质，甚至是完整的植物结构。土壤群落几乎完全减少到微生物初级生产和消费水平，这使mofette成为研究多样性对特定土壤功能影响的模式环境。支持mofette和对照土壤中SOM降解高度相似的生化潜力的证据令人惊讶，并暗示土壤生物群落中特定酶特性存在一定程度的冗余。我们的研究对极端二氧化碳浓度对不同官能团代谢的影响进行了可测试的预测，并展示了分子和生物地球化学的综合方法如何为土壤群落之间的复杂关系和土壤C动态的调控提供了新的见解。
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