综述 | Nature子刊：关于肠球菌生物膜的那点事（IF：31.851）
本文由谭玉龙编译，董小橙、江舜尧编辑。
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肠球菌是存在于人和动物肠道中革兰氏阳性菌，这些兼性厌氧菌对多种环境条件具有高度耐受性，比如极端pH，温度和盐浓度。这种耐受性有助于它们在多种宿主生态位的定植。共生肠道肠球菌在健康宿主中通常不致病，但在易感宿主中，则可引起感染。肠球菌形成生物膜的能力增强了它们的耐受性，并有助于它们在感染期间对环境和食品工业的持久污染。已在许多感染中观察到肠球菌生物膜，包括泌尿道，伤口，生理性胃肠道和心内膜炎。生物膜相关的肠球菌感染不仅难以根除，而且还可作为细菌传播的病灶和抗生素抗性基因的储库。
论文ID
原名：Biofilm-associated infection by enterococci
译名：生物膜相关的肠球菌感染
期刊：Nature Reviews Microbiology
IF：31.851
发表时间：2018年
通信作者：Kimberly A. Kline
通信作者单位：Nanyang Technological University, Singapore
综述内容
生物膜的形成
生物膜发展一般包括四个阶段：初始附着，微菌落形成，生物膜成熟和分散。与部分模式生物膜相比，肠球菌生物膜的发展尚未被完全了解。
表面粘附是建立生物膜的第一步，一些表面粘附素，蛋白酶和糖脂在这个早期阶段起作用。生物膜相关的菌毛（Ebp）由亚基A，B和C组成，在体外和体内介导了最初的表面粘附。缺失ebpABC减弱了与血小板，纤维蛋白原和胶原蛋白的结合，减少了初始附着，从而减少了体外生物膜的形成。类似地，表面粘附素的缺失，包括聚集物质（Agg），肠球菌表面蛋白（Esp）和来自肠球菌的胶原蛋白的粘附（Ace），会降低对培养的体细胞的粘附，并减弱体内生物膜的形成。
在初始附着后，细菌开始繁殖并产生少量的生物膜基质，形成称为微菌落的聚集体。然而，驱动微菌落形成的肠球菌因子尚不清楚，也没有来自早期生物膜或微菌落的转录组学数据。已有证据表明微菌落与肠道定植的相关性。尽管微菌落通常被认为是早期生物膜发育的短暂阶段，但研究结果表明，微菌落对于肠道定植尤为重要。此外，肠球菌在体外形成微菌落以对应抗生素治疗。
生物膜成熟需要胞外基质组分的活跃产生，例如细胞外DNA（eDNA），多糖，LTA和细胞外蛋白酶。肠球菌生物膜的最佳表征基质成分是eDNA，用DNase处理降低了生物膜稳定性并增加了分散，因此eDNA可作为潜在的治疗靶点。非蛋白的细胞表面结构，包括糖蛋白，多糖和修饰的脂质，也有助于生物膜的发展。dltABCD操纵子参与LTA的d-丙氨酸酯的生产，LTA是革兰氏阳性细菌细胞壁的重要组成部分，该操纵子的缺失减少了体外生物膜的形成，降低了对上皮细胞的依从性，增加了对抗菌药物的敏感性。此外，删除多肽抗性因子MprF，也增加了eDNA释放和生物膜生长。这些观察结果支持这样的假设：细胞表面糖蛋白，膜磷脂酰甘油和多糖有助于生物膜成熟。
肠球菌生物膜的形成与发展
生物膜的耐药性
生物膜基质的低渗透性和持久性细胞的存在，有助于生物膜对抗生素产生耐受性，并导致持续感染。尽管对肠球菌中的持久性细胞形成知之甚少，但肠球菌需要使用鸟嘌呤四磷酸（ppGpp）来耐受破坏细胞壁的抗生素。ppGpp在几乎所有细菌中普遍存在，被认为通过差异调节~500个基因来减缓生长。然而，ppGpp在持久细胞形成中所起的作用似乎是药物特异性的，并且取决于培养条件。因此，需要进一步的工作来确定肠球菌细胞形成的确切机制，并确定它们在生物膜持久性中的作用。
解决肠球菌对抗生素的耐药性是全球健康的优先事项：屎肠球菌本身对抗生素的耐药性比粪肠球菌更强，而粪肠球菌可形成较厚的生物膜，能够耐受抗生素。与浮游细胞的最小抑菌浓度（MICs）相比，临床粪肠球菌分离株的生物膜对替加环素和万古霉素具有更高的耐受性。此外，较成熟的生物膜对抗生素的耐受性增加，临床粪肠球菌和屎肠球菌分离株的第3天和第5天生物膜显示出比第1天生物膜更高的万古霉素生物膜根除浓度（MBEC）。此外，如果利福平与1日龄生物膜中的其他抗生素联合使用，对MBEC有协同作用，但这种效应在成熟生物膜中不存在。该效果潜在的机制尚未确定，但可能是由于成熟生物膜中基质生成水平较高，因此抗生素渗透率较低或抗生素耐药细胞增加。生物膜基质的数量和组成有助于许多菌种的毒力和持久性的产生，但尚未对肠球菌有相关研究报道。
浮游菌和生物膜菌对抗生素的反应不同。在体外，万古霉素处理的粪肠球菌生物膜细胞的转录组揭示了其与浮游细胞不同的101种差异调节基因。编码ATP结合区域（ABC）的转运蛋白和青霉素结合1A家族蛋白的调节水平最高，表明与浮游菌相比，生物膜相关细菌中抗生素外排和β-内酰胺类抗性增加。相比之下，与浮游细胞相比，未经处理的屎肠球菌生物膜细胞中具有776个差异表达的基因。抗生素抗性基因tetS和与移动遗传元件相关的基因的上调表明，屎肠球菌生物膜可通过增加tetS表达和促进生物膜细胞之间的遗传交换来抵抗四环素。
大多数肠球菌生物膜的相关感染是多菌种混合的，在感染部位存在两种或更多种微生物。新一代测序鉴定表明，在CAUTI和伤口感染中，肠球菌占很大比例。几种尿路病原体经常与粪肠球菌共同被分离出来。例如，在近40％的粪肠球菌生物膜中发现了奇异变形杆菌。糖尿病性溃疡，烧伤和手术伤口中的肠球菌通常与金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌，棒状杆菌被共同分离出来。鉴于这些生物体与肠球菌共存的频率及其在多种生物膜中的密切相互作用，了解种间关系可能是对抗复杂感染的关键。
肠球菌与其他菌种在混合菌种生物膜中的关系
生物膜相关感染的解决方案
生物膜的多种特性，包括表型抗生素耐受性和混合菌种群落的协同保护特性，使生物膜难以接受标准的抗菌疗法。 因此，应尽可能优先防止生物膜形成。
可以使用抗粘附或抗菌表面涂层来防止在导管和植入物的表面上形成生物膜。用于预防或减少肠球菌生物膜形成的有效涂层包括不可浸出的阳离子薄膜涂层，石墨烯涂层，表面活性剂涂层和骨的磺化类似物。在这些涂层中，导尿管涂层具有最大的医学益处，但需要进一步验证更多实验室菌株和临床分离株以及增加临床前研究。
防止生物膜形成的另一种方法是使用EbpA作为针对CAUTI的疫苗。EbpA位于菌毛尖端，介导粪肠球菌与纤维蛋白原的相互作用，并在生物膜形成中起主要作用。用EbpA接种的小鼠在2周后产生抗体，其赋予针对CAUTI的保护。随后对10种粪肠球菌和屎肠球菌菌株的研究表明，抗体具有普遍的保护作用。尽管开发疫苗前景很大，但疫苗接种必须在导管插入之前进行，免疫功能低下的个体可能无法对疫苗接种做出充分反应。为了克服这些限制，可以考虑使用抗体疗法（被动免疫）。这项工作仍处于初步阶段，未来的研究应检验这种疗法对CAUTI生物膜的效用，另外，还应研究抗体疗法是否会去除已存在的肠球菌生物膜。
由于预防并非总是可行，因此必须去除已形成的肠球菌生物膜。已尝试联合抗生素治疗，但效果不显著。在一项研究中，与单一疗法相比，使用氨苄青霉素，内酰胺素，头孢洛林和头孢曲松的组合都未能显示出对1日龄粪肠球菌生物膜的协同效应。即使浓度高达MIC的1000倍，生物膜都不会受到影响。相比之下，另一项研究表明，利福平改善了抗生素对粪肠球菌和屎肠球菌生物膜的作用。然而，这种效应仅限于1日龄的生物膜而不是较旧的生物膜。除了抗生素组合之外，还建议降解细胞外聚合物以使粪肠球菌对抗生素敏感。由于eDNA是粪肠球菌早期生物膜基质的组成部分，因此它具有种潜在的靶标。在一项关于基质消化对万古霉素杀灭的协同作用的小型研究中，临床粪肠球菌分离株的生物膜被DNase致敏，而屎肠球菌生物膜通过藻酸盐裂解酶致敏。然而，在酶消化生物膜基质后，完全根除所有生物膜细胞所需的万古霉素浓度没有变化。总之，这些发现重申抗生素不足以完全清除生物膜。
虽然消毒对浮游细胞有效，但生物膜对消毒有抗性，这与复发性牙髓感染特别相关。通常用于对根管表面进行消毒的次氯酸钠未能根除牙本质板上生长的单种粪肠球菌生物膜。可以添加纳米颗粒以增强次氯酸盐和其他非区分性氧化剂的作用。在根管中生长3周的粪肠球菌生物膜中，氧化铁纳米粒子可迅速结合到生物膜覆盖的表面，其过氧化物酶样活性增加了过氧化物在牙本质小管所有深处杀死生物膜细胞的效力。尚未确定这种方法是否可以适应其他部位，如伤口和导管。
生物膜分散期间浮游细菌的释放使它们对抗生素敏感，并提供了辅助治疗的机会。草药提取物盐酸小檗碱通过下调分选酶A和esp分散粪肠球菌UTI分离株的生物膜。噬菌体疗法也被认为可以促进生物膜分散。有趣的是，从污水中分离出的粪肠球菌和屎肠球菌噬菌体EFDG1对十种临床分离株有效，并且显示出抗生物膜潜力。在体外，EFDG1几乎完全根除了100μm厚的耐万古霉素生物膜，并将粪肠球菌降低了4个对数级别。此外，EFDG1还可以防止离体根管感染模型中的细菌生长，并将粪肠球菌降低8个对数级别。虽然必须仔细评估噬菌体疗法，但可以进一步研究EFDG1在其他肠球菌生物膜疾病模型中的功效。话虽如此，但仍然必须谨慎对待使用分散作为生物膜根除手段的方法。据报道，与浮游细胞相比，分散的铜绿假单胞菌细胞的毒力基因表达增加，巨噬细胞吞噬倾向降低。分散的肠球菌生物膜尚未得到类似的研究，目前还不清楚肠球菌扩散是否会导致临床上令人满意的结果。
屎肠球菌和粪肠球菌生物膜形成因子的异同
尽管开发针对肠球菌生物膜的治疗具有挑战性，但开发针对临床上普遍存在的多菌种生物膜的治疗方法的任务可能更为严峻。对多菌种生物膜的考虑必须从检测开始，并且应该使用分子方法来检测可能影响感染结果的低水平存在的微生物。最近一项关于慢性伤口动态的研究表明，生物膜的物种组成随治疗而变化，治疗后成为主导的物种已经在较早阶段检测到，但丰度较低。随着肠球菌对抗生素的普遍存在，它们在多菌种生物膜中的存在，即使在低水平，也应该引起关注。
结 论
在导尿管和伤口上生长为生物膜的肠球菌是导致感染的最常见原因，并且随着全球人口持续老化，住院率增加和合并症等变得更加普遍。但我们仍然缺乏对肠球菌生物膜中抗生素耐药性机制的透彻理解。为预防和对抗肠球菌生物膜相关感染，我们必须首先了解生物膜形成的机制。主要的挑战在于对介导生物膜发育的每个阶段的肠球菌因子的完整时空表征。需要通过结合光学检测与元组学和系统水平分析的技术，以及CAUTI和伤口感染的动物模型，来准备应对这些挑战并设计针对肠球菌生物膜感染的新的有效疗法。
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