科研 | Gut Microbes：粪便细菌微生物群的变化与酒精性肝炎患者的疾病严重程度有关
编译：yuan，编辑：小菌菌、江舜尧。
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酒精性肝炎是酒精相关肝脏疾病中最严重的。众所周知，肠道微生物组在疾病发展中发挥作用，但对于肠道细菌微生物特定成分的变化与疾病严重程度的关系所知甚少。因此，本研究的目的是探讨酒精性肝炎患者的疾病严重程度与肠道微生物群特性的关系。我们对来自欧洲、美国和墨西哥（多中心观察研究）9个中心的74例酒精性肝炎患者的粪便样本进行16S rRNA基因测序。将肠道细菌属水平相对丰度和微生物组多样性与各种临床、实验室和组织学参数进行关联。我们观察到终末期肝病模型（MELD）评分和Shannon多样性之间存在独立于潜在混杂因素的负相关关系(Padjust = 0.046)。酒精性肝炎患者中更严重患者的Akkermansia相对丰度显著下降，Veillonella相对丰度显著增加。我们观察到抗生素治疗患者的Bacteroides丰度 (Padjust = 0.048)和Shannon多样性(Padjust = 0.018) 下降，类固醇治疗患者的Veillonella增加 (Padjust = 0.005)，均独立于潜在的混杂因素影响。结论：我们观察到更严重的酒精性肝炎患者的肠道细菌微生物的独特变化。肠道细菌微生物可能是一个预防和治疗这种致命疾病的有吸引力的目标。
论文ID
原名：Changes in the fecal bacterial microbiota associated with disease severity in alcoholic hepatitis patients
译名：粪便细菌微生物群的变化与酒精性肝炎患者的疾病严重程度有关
期刊：Gut Microbes
IF：7.740
发表时间：2020.7
通讯作者：Bernd Schnabl
作者单位：加州大学圣地亚哥分校医学系
实验设计
本研究共纳入74例住院的酒精性肝炎患者。纳入标准：在过去三个月内必须满足(1)过度饮酒(男性：> 50克/天；女性：> 40克/天)，(2)天冬氨酸转氨酶(AST) >丙氨酸转氨酶(ALT)和总胆红素> 3g/dl，(3)肝活检和/或临床情况符合酒精性肝炎(所有肝活检均是在常规临床护理要求下进行)。排除标准：
(1)其他肝胆的病理学诊断，包括自身免疫性肝病、慢性病毒性肝炎、肝细胞癌和门静脉血栓，
(2)其他重要的并发症，如糖尿病患者、炎症性肠病或临床上重大心脏、肺、肾异常，
(3)怀孕，
(4)缺乏书面知情同意。
人类粪便样本中提取DNA，扩增V4区后进行测序。结果表示为中位数和范围，除非另有声明。细菌序列被标准化后计算比例和相对丰度。两组连续变量比较使用Mann-Whitney-Wilcoxonrank-sum检验，分类变量比较使用确切概率法。采用Spearman相关性对细菌属水平相对丰度和临床参数进行关联分析。采用条件Spearman来矫正混杂。采用多元线性模型分析(MaAsLin)检测多个临床数据和微生物群落丰度的之间的独立关联，图中只显示显著关联(P <0.05)。采用Bray-Curtis差异矩阵进行主坐标分析(PCoA)，采用矫正潜在的混杂因素的置换多元方差分析(PERMANOVA)计算P值。采用多元logistic回归分析进一步校正潜在的混杂因素。所有统计均使用R统计软件进行双面检验，P值<0.05是具有统计学意义。
结果
研究队列的中位年龄为49岁，67%为男性。三分之一接受类固醇治疗，49%接受抗生素治疗（包括预防性抗生素），终末期肝病模型（MELD）评分中位数为24（表1）。根据MELD评分高于21分进行分层，重度酒精性肝炎患者的纤维化程度明显较高，但在年龄、性别、种族和地理来源方面没有观察到显著差异（补充表1）。
为初步了解酒精性肝炎患者肠道菌群与临床、实验室和组织学参数之间的潜在联系，我们进行了热图分析，展示了属水平上最丰富的肠道细菌和整体微生物多样性与临床、实验室和组织学参数的Spearman相关性（用颜色标记）。最显著的是与疾病严重程度相关参数（MELD评分、胆红素沉着、白蛋白水平）、治疗方式（抗生素和类固醇）以及肝脏组织学炎症性改变有关。自我报告酒精摄入量的平均值较高与Enterococcus和Lactobacillus丰度较高有关，但与细菌多样性差异无关（图1）。
图1.酒精性肝炎肠道菌群与临床指标的关系。热图表示临床参数的Spearman相关性。红色表示正相关，蓝色表示负相关。所有变量的编码从低到高，即抗生素中的红色表示抗生素的使用与各个细菌呈正相关。*0.01<P<0.05，**0.001<P<0.01，***P<0.001。PMN，多形核白细胞浸润；INR，国际标准化比率；ALT，丙氨酸转氨酶；AST，天冬氨酸转氨酶；AP，碱性磷酸酶；BMI，体重指数；MELD，终末期肝病模型。
1 酒精性肝炎的严重程度与肠道微生物组的组成和多样性的变化有关
为探讨酒精性肝炎患者肝脏疾病的严重程度是否与肠道微生物组相关，我们根据MELD评分高于21对患者进行分组，这是区分重度和非重度酒精性肝炎的常用标准。由于这两组患者的数量非常不均衡（高MELD组n=54，低MELD组n=18），我们还根据中位胆红素水平（14.1 mg/dl）进行了分组比较。
我们通过对323个肠道细菌属进行主坐标分析(PCoA分析)，比较组间的整体肠道微生物组组成。在校正抗生素、类固醇和己酮可可碱治疗、种族和患者所在中心后，高胆红素患者组（＞14.1 mg/dl，n=36）与低胆红素组（≤14.1 mg/dl，n=37）的聚集显著不同（Padjust=0.010）（图2a，左上）。病情较重的组中，Veillonella和Enterococcus显著增加，Akkermansia显著减少（图2a，右上）。Veillonella丰度作为连续变量，其升高与胆红素水平显著相关，独立于抗生素、类固醇、己酮可可碱、种族和中心来源（Padjust=0.026，图2a，左下）。MaAsLin分析显示了几个细菌属和高胆红素水平之间存在显著的独立关联，其中高胆红素组中Akkermansia丰度显著降低是一个主要发现（图2a，右下）。高胆红素患者与低胆红素患者的Shannon指数无显著差异（Padjust=0.289）。
只有18名患者的MELD评分≤21分，而54名患者的MELD评分＞21分。在比较高MELD与低MELD的酒精性肝炎患者之间的整体微生物组组成时，PCoA分析并没有显著差异（图2b，左上）。当我们把MELD看作连续变量，研究其与微生物多样性（Shannon指数）之间的联系时，我们发现MELD评分越高与细菌多样性越低显著相关，独立于抗生素、类固醇和己酮可可碱治疗、种族和中心起源（估计值-0.26，标准误差0.13，Padjust=0.046，图2b，左下）。在MaAsLin分析中，未分类Clostridales、未分类Prevotellaceae和Anaerostipes的相对丰度较低是高MELD患者的独立特征（图2b，右下）。
总的来说，这些数据表明酒精性肝炎患者更严重与细菌多样性减少和组成变化有关。
图2. 疾病严重程度与肠道微生物群的关系。（A）左上图展示主坐标分析(PCoA)，是基于属水平323个细菌的丰度来显示组间的ß-多样性。轴表示Bray–Curtis距离度量中两个最具区分性的轴。P值采用置换多元方差分析（PERMANOVA）确定。右上图展示每组每个属的序列读数的平均相对丰度（根据队列中胆红素的中位数14.1mg/dl对酒精性肝炎患者进行分组）。左下图展示胆红素水平和Veillonella相对丰度之间的Spearman相关性。右下图展示323个细菌属的MaAsLin（通过线性模型进行的多元分析）。胆红素>14.1mg/dl: n=37；胆红素≤14.1 mg/dl：n=36。（B）左上图展示PCoA分析，是基于属水平323个细菌的丰度来显示组间的ß-多样性。轴表示Bray–Curtis距离度量中两个最具区分性的轴。P值采用PERMANOVA确定。根据MELD评分高于或低于/等于21分对酒精性肝炎患者进行分组。右上图表展示每组每个属的序列读数的平均相对丰度。左下图展示Shannon指数和MELD评分之间的负Spearman相关性。右下图展示MaAsLin的结果。除右上图外，所有分析均校正抗生素、类固醇、己酮可可碱、种族和中心来源。MELD>21: n=54；MELD≤21：n=18。
2 抗生素和类固醇治疗引起的肠道细菌改变
接下来，我们将抗生素和类固醇治疗与酒精性肝炎患者肠道微生物组多样性和组成的变化联系起来。在进行包括所有检测到属的相对丰度的PCoA分析时，各治疗组的肠道微生物组组成存在显著差异（Padjust<0.01），校正其他治疗（分别为类固醇/抗生素/己酮可可碱）、中心来源、胆红素、白蛋白水平、肌酐、国际标准化比率（INR）和血小板计数（图3和图4，左上）。当我们比较抗生素治疗组和未使用抗生素患者的15个最丰富属的平均相对丰度时，最显著的变化是抗生素治疗患者的Bacteroides丰度减少和Escherichia/Shigella丰度增加（Bacteroides平均相对丰度：未使用抗生素组26% vs抗生素治疗组12%，Padjust=0.048，图3，右上和右中）。在MaAsLin分析中，抗生素的使用与Blautia、Clostridiumspp.、Roseburia、Dorea和其他几个属的低水平独立相关（图3，左下）。此外，Shannon指数显示细菌多样性减少（图3，右下，Padjust=0.015）。
类固醇治疗患者与未使用类固醇患者相比，最显著的差异是Veillonella abundance增加（Veillonella abundance平均相对丰度：未使用类固醇组8% vs类固醇治疗组27%，Padjust=0.003，图4，右上和下面），并且与疾病严重程度（胆红素、白蛋白、肌酐、INR和血小板计数）、同时使用抗生素、种族或中心起源无关。类固醇治疗组与未使用类固醇组的Shannon指数无显著性差异（Padjust=0.820）。
这些数据表明，使用抗生素和类固醇治疗可能会导致酒精性肝炎患者肠道菌群的改变。
图3. 抗生素治疗与肠道细菌的关系。左上图展示主成分分析，是基于属水平323个细菌的丰度来显示组间的ß-多样性。轴表示jaccard距离度量中两个最具区分性的轴。P值采用PERMANOVA确定。右上图展示每组每个属的序列读数的平均相对丰度（根据抗生素治疗(包括预防性抗生素)对酒精性肝炎患者进行分组n=35(49%)）。右下图展示抗生素治疗患者的Bacteroides丰度下降和Shannon多样性指数下降。Wilcoxon-Mann-Whitney检验。左下图展示323个细菌属的MaAsLin结果。除右上图外，所有分析均校正类固醇和己酮可可碱治疗、中心来源、胆红素、白蛋白、肌酐水平，国际标准化比值（INR）和血小板计数作为疾病严重程度的标志物。
图4. 类固醇治疗与肠道细菌的关系。左上图展示主成分分析，是基于属水平323个细菌的丰度来显示组间的ß-多样性。轴表示jaccard距离度量中两个最具区分性的轴。P值采用PERMANOVA确定。右上图展示每组每个属的序列读数的平均相对丰度（根据入院时类固醇治疗对酒精性肝炎患者进行分组，n=22(31%)）。右下图展示类固醇治疗患者Veillonella增多。Wilcoxon-Mann-Whitney检验。左下图展示323个细菌属的MaAsLin结果。除右上图外，所有分析均校正类固醇和己酮可可碱治疗、中心来源、胆红素、白蛋白、肌酐水平，国际标准化比值（INR）和血小板计数作为疾病严重程度的标志物。
3 肝活检组织学改变与微生物组的关系
接下来，我们研究了肝脏组织学参数是否与肠道微生物组组成的特定变化有关。脂肪变性程度最高的酒精性肝炎患者的粪便比脂肪变性程度较低的患者的粪便的Enterococcus多（图5a，上）。在MaAsLin分析中，Bifidobacterium, Lactococcus, Oribacterium, Desulfovibrio,Enterococcus和Veillonella是3级脂肪变性患者中增加最多的细菌（图5a，下）。多形核浸润程度较高（图5b，上）和组织学炎症程度较高（图5c，上）的患者中，Akkermansia含量较低。进一步，我们观察到肝活检中炎症更严重的患者中Veillonella更高（图5c）。虽然一些低丰度的肠道微生物与纤维化较低相关，但在比较酒精性肝炎肝硬化患者（n=25）与非肝硬化患者（n=16）时，我们没有观察到明显的变化（图5d）。
图5。与肠道微生物群相关的肝脏组织学特征。（A）上图展示各组各属的序列平均相对丰度（根据肝组织学上的脂肪变性程度对酒精性肝炎患者进行分组（1，n=16；2，n=12，3，n=13））。下图展示323个细菌属的MaAsLin结果。（B）各组各属的序列平均相对丰度和MaAsLin结果（根据肝组织学上的PMN（多形核）浸润对酒精性肝炎患者进行分组（1，n=9；2，n=18，3，n=14））。（C）各组各属的序列平均相对丰度和MaAsLin结果（根据肝脏组织学炎症分级对酒精性肝炎患者进行分组（0，n=11；1-2，n=30））。（D）各组各属的序列平均相对丰度和MaAsLin结果（根据肝组织学上的肝纤维化分期对酒精性肝炎患者进行分组（0-3，n=16；4，n=25））。
讨论
本研究描述了酒精性肝炎患者粪便微生物群变化与疾病严重程度、抗生素和类固醇的使用以及肝活检的组织学变化的相关性。越来越多的数据表明微生物组在肝病的发病机制中起着重要作用，因此需要更好地描述临床实践中常见发现有关的特定变化。
酒精性肝炎的预后变化很大，但重症患者死亡率特别高。在本研究中，MELD评分和高胆红素血症程度被用作疾病严重程度的替代物。在更严重的肝病患者中，Veillonella的相对丰度增加。Veillonella具有未知的致病性，被普遍发现在肝病患者中。Kakiyama et al.发现在肝硬化患者中Veillonellaceae（科）增加，当肝硬化的病因是酒精诱导时，这种增加更为显著。
肠道中微生物多样性对微生物组和人类宿主之间的健康共生关系至关重要。肠道细菌多样性降低与各种不良后果有关，如肥胖和炎症性肠病。虽然有研究表明肝硬化患者的细菌多样性往往减少，但是关于酒精相关性肝病的严重程度和微生物组异质性几乎没有数据。Ciocan et al.发现，与无肝病的酒精对照组相比，重度酒精性肝炎患者的多样性稍有降低，尽管没有达到统计学意义。他们使用组织学评分系统来定义严重疾病，但是他们没有与病情较轻的酒精性肝炎患者相比较。在本研究中，我们发现MELD评分与细菌多样性之间存在显著的负相关，与抗生素或类固醇治疗无关。总的来说，这些发现表明酒精性肝炎患者疾病严重与微生物组的细菌多样性减少有关。
很少有研究描述微生物组与酒精性肝炎疾病严重程度的关系。Smirnova et al.最近一项研究在比较中度和重度酒精性肝炎时（MELD≥21），没有发现肠道菌群组成或多样性的显著差异；但是，可能是患者数量较低（分别只有10名和24名）限制了达到统计显著性的能力。中度和重度酒精性肝炎患者的个别细菌存在一些显著差异，包括Actinomycetaceae和Fusobacteriaceae的丰度增加。作者利用所有饮酒组的MELD评分（无论是否存在酒精性肝炎）制定了一个微生物组预测模型，并确定了有助于该模型准确预测MELD评分＞20的前20个属。其中，Veillonellaceae Veillonella、Lachnospiracea incertaesedis, Bacteroidaceae Bacteroides和StreptococcaceaeStreptococcus是最丰富的细菌。在我们的研究中，并没有在高MELD组中看到这些特定细菌的增长。
Llopis et al.使用组织学评分系统（酒精性肝炎评分）来确定酒精性肝炎的严重程度，发现了重症患者中Streptococci、Bifidobacteria和Enterobacteria的增长。Streptococci和Enterobacteria均与酒精性肝炎评分呈正相关，Enterobacteria与血清胆红素水平也呈正相关。最近，Puri et al. 检测了MELD＞20的酒精性肝炎患者的循环微生物组。他们注意到重度酒精性肝炎患者的循环微生物组中Brevibacterium和Staphylococcus比中度酒精性肝炎患者高。所有饮酒患者在内的回归分析发现，MELD评分与Janthinobacterium和Enhydrobacter（蛋白质细菌门的两个属）之间存在负相关。我们在分析中没有看到这些关联，但需要注意的是Puri et al.是利用全血样本进行16S rRNA基因测序的。
抗生素的使用也被证明会降低健康人的肠道细菌多样性。在我们的研究中，抗生素治疗与酒精性肝炎患者细菌多样性较低相关。降低程度最大的是Bacteroides，它在很大程度上被认为是肠道环境中的有益有机体。虽然一些研究表明，在肝硬化患者中类杆菌科（Bacteroidaceae）的数量增加了，但当分析包括或仅限于酒精性肝硬化时，这种联系似乎颠倒了，显示出Bacteroidaceae的减少。在我们的研究中，抗生素治疗组的anaerobes Bilophila和Flavonifractor也有显著增加，这两种都是罕见的临床病原体，但都与全身炎症和/或结直肠癌有关。然而，我们的研究设计不能回答：使用抗生素使用与否和这些观察结果是因果关系。
我们发现在接受类固醇治疗的酒精性肝炎患者中，Veillonella相对丰度显著增加。在临床实践中，类固醇的使用通常只限于重度酒精性肝炎，通常是在Maddrey判别函数评分超过32分并且没有禁忌症存在的时候。由于我们已经确定Veillonella在严重高胆红素血症患者中更为普遍（这是Maddrey判别函数评分的一个组成部分），我们推断这种关联可能至少有一部分归因于疾病的严重程度。然而，在对与疾病严重程度（包括胆红素水平）相关的参数进行多变量logistic回归分析后，Veillonella丰度与类固醇使用之间的关联仍然显著。虽然需要进一步的机制研究来阐明Veillonella在酒精性肝炎中的潜在致病功能，但这项研究证实了Veillonella也与疾病的严重程度呈正相关，并且可以通过使用类固醇独立地增大。
我们还评估了酒精性肝炎患者粪便微生物群与各种肝脏组织学变化的关系。严重的脂肪变性与Enterococcus增加有关，Enterococcus在很大程度上被认为是致病性有机体。当我们评估炎症组织学变化，如PMN浸润和炎症分级时，Akkermansia丰度与炎症增加呈负相关，并且在胆红素水平较高的患者中也降低。Akkermansia是一种被广泛接受的有益的人类微生物群落，对脂肪酸代谢很重要。它的耗竭与肥胖和脂肪性肝病有关，补充Akkermansia甚至被证明可以降低肥胖小鼠的血清甘油三酯和丙氨酸转氨酶水平。最近，Addolorato et al.发现，无论肝病程度如何，酒精使用障碍患者的Akkermansia显著减少。一致地，Grander et al在酒精性肝炎患者的粪便样本中发现Akkermansia的缺失，并且补充Akkermansia可以保护实验性酒精性肝病小鼠免受肝损伤。我们的研究表明，Akkermansia丰度的减少与酒精性肝炎患者的肝活检炎症程度有关。
本研究的主要优势是其国际多中心设计，旨在控制可能影响微生物组组成的各种地理和民族因素。据我们所知，我们的研究对大量酒精性肝炎患者的粪便样本进行了测序，这些样本来自欧洲、美国和墨西哥的多个中心。然而，我们的研究是描述性的，并且由于无法确定因果关系。此外，使用抗生素、类固醇和己酮可可碱以外的药物的报道并不完整；因此，我们不能排除其他伴随用药可能会影响我们的结果。进一步的机制研究需要更好地理解微生物组在酒精性肝炎发病和发展中的作用。
结论
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