科研 | Cell Metabolism：前驱糖尿病和糖尿病患者的肠道菌群变化
编译：莫沉，编辑：小菌菌、江舜尧。
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近年来，有关糖尿病与肠道微生物的研究引起了人们的广泛关注，研究发现肠道菌群在糖尿病的发生、发展以及治疗中发挥重要作用。然而，由于糖尿病发病的复杂性以及治疗手段的混杂效应，肠道菌群与2型糖尿病(type 2 diabetes, T2D)之间的联系仍然有待进一步地研究。
在本研究中，该研究团队分别通过检测发现队列(n=1,011)和验证队列(n=484)中患者的肠道菌群结构，该队列包括未接受糖尿病治疗的瑞典受试者，并根据血糖水平进行分组。
研究者发现，糖尿病患者肠道微生物的整体组成在葡萄糖耐量受损、复合型糖耐量受损和T2D组中发生显著改变，但在空腹血糖受损的组中没有改变。此外，在前驱糖尿病和T2D组中，几种丁酸盐产生菌的丰度以及丁酸的产生潜力都显著降低。此外，多变量分析和机器学习微生物模型表明，胰岛素抵抗与微生物丰度变化密切相关。因此，该研究表明，在研究预防和延缓T2D的精确治疗策略时，肠道微生物是一个需要考虑的重要的可变因素之一。
论文ID
原名：The Gut Microbiota in Prediabetes and Diabetes: A Population-Based Cross-Sectional Study
译名：基于人群队列横断面研究的前驱糖尿病和糖尿病患者的肠道菌群变化
期刊：Cell Metabolism
IF：21.567
发表时间：2020.7.24
通讯作者：Fredrik Backhed
作者单位：瑞典哥德堡大学分子与临床医学系
实验设计
实验设计图
结果
1 研究队列概述
本研究的受试者根据其空腹和2小时内口服葡萄糖耐量试验(oral glucose tolerance test, OGTT)的血糖水平分别纳入到两个队列中，并根据1999年世界卫生组织(Geneva)的标准将其分为不同的亚组。本研究中，研究者共招募了189名单纯性空腹血糖受损(impaired fasting glucose, IFG)患者、178名单纯性糖耐量受损(impaired glucose tolerance, IGT)患者、75名合并糖耐量不耐受(combined glucose intolerance, CGI)患者和46名糖尿病治疗前期T2D患者纳入到发现队列。此外，为了探究具有T2D危险因素但没有葡萄糖耐受表型改变的患者的肠道微生物的变化，研究者根据患者的糖尿病风险评分(FINDRISC)和患有T2D的一级亲属的数量，将糖耐量正常(normal glucose tolerance, NGT)的个体分为T2D的低风险组和高风险组。该研究总共招募了523名NGT患者，226名低风险患者和297名T2D高危患者纳入发现队列(表1)。
与低危NGT组相比，其他五组的体重、BMI、血压和空腹甘油三酯水平均较高(表1)。平均年龄在57.6岁至59.9岁之间，各组之间仅有轻微的年龄差异。与低风险NGT组相比，T2D组的空腹总胆固醇和低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL)胆固醇较低，这与该组中服用他汀类药物的个体比例相一致(表1)。除了胰岛素抵抗和血糖状态的预期变化外，研究者还进一步分析了炎症、免疫反应和微生物代谢相关变量的逐步变化，发现糖尿病前期组之间存在一定的异质性。IGT、CGI和T2D组的高敏C反应蛋白(通常作为炎症的一般标志)和单核细胞显著高于低危NGT(lrNGT)组，而中性粒细胞、白细胞和检测到的细菌代谢物丙酸咪唑的血浆游离水平仅在CGI和T2D组显著增加(表1)。
表1 根据血糖水平划分的发现队列中受试者的临床基本特征。
研究者还从瑞典心肺生物影响研究(Swedish Cardiopulmonary Bioimage Study,SCAPIS)中的哥德堡队列中招募了一部分人纳入验证队列，其中NGT组206人，IGT组132人(在体重指数、年龄和性别上与NGT组匹配)，CGI组88人，T2D组58人。与NGT组相比，CGI和T2D组的体重、BMI、血压和空腹甘油三酯更高(表2)。NGT组和T2D组的空腹总胆固醇和LDL胆固醇以及服用他汀类药物的患者比例相似。
表2 根据血糖水平划分的验证队列中受试者的临床基本特征。
2 前驱糖尿病和糖尿病患者肠道微生物组成变化
基于发现队列中肠道微生物的主坐标分析显示，IGT、CGI和T2D组的肠道微生物组成与低危NGT组的肠道微生物组成发生了显著的变化。而在IGT、CGI和T2D组中，IGT、CGI和T2D组的肠道微生物组成与低危NGT组相比发生了显著的变化。但在高危和低NGT组之间(p=0.086)，在IFG组和低危NGT组之间(p=0.069)，或者在CGI组和T2D组之间(p=0.14.图1A)，该研究没有观察到显著的组成变化。与此同时，在验证队列中微生物组成的变化也得到了类似的结果(图1A和S3A)。研究者重新分析发现队列中低风险和高风险NGT组合，将其作为参考分析时，也发现上述类似的结果，即IGT、CGI和T2D组合与NGT组合在肠道微生物组成上有显著差异，而在IFG组和NGT联合组之间则没有显著差异。在发现队列中，基于距离的冗余分析显示，在对所有其他非线性变量(STAR Methods)进行调整后，微生物的丰度变化(相对于低风险NGT组)与空腹血糖无关，并且仅在IGT和低风险NGT组中发现与2h OGTT血糖水平相关(图1B)。其他8个变量，包括甘油三酯-葡萄糖指数、维生素D和淋巴细胞，而不是性别、胰岛素抵抗的稳态模型评估(homeostatic model assessment of insulin resistance, HOMA-IR)、他汀类药物或质子泵抑制剂的治疗，与发现队列中的肠道微生物组成变化独立相关(图1B)。
接下来，研究者进一步开发了一个基于随机森林算法的机器学习分类器，通过菌群差异从NGT中来区分患有CGI或T2D(CGI/T2D)的患者(图2)。结果表明，该模型具有中等的预测能力，在发现队列中，AUC为0.70(图2A)，真实预测de AUC(即，在验证队列中)为0.64，上述结果与使用FINDRISC(AUC，0.65)(图2B)获得的结果相似。将基于微生物组的分类器添加到FINDRISC中，可以将该预测模型的预测性能提高到0.70 (图2B)。在验证队列的NGT组中，被基于微生物组的模型错误分类的个体的胰岛素抵抗(根据甘油三酯-葡萄糖指数和HOMA-IR的测量)显著高于被正确分类的个体(图2C)。同样，在CGI/T2D联合组中，错误分类的个体比正确分类的个体胰岛素抵抗更低(图2C)。当在由100人组成的验证队列的亚组中重新评估该研究开发的基于微生物的分类器时，在来自胰岛素抵抗最低和最高的NGT和CGI/T2D组合组，肠道微生物预测模型可以识别出CGI/T2D的AUC为0.78(图2D)。
在发现队列中，与低风险NGT组相比，118种宏基因组学物种的丰度在至少一组血糖状态发生变化的组中发生了显着变化。其中只有Clostridia bacterium，Faecalibacterium sp和Eubacterium rectale在男性和女性之间显示了显著的差异，并且仅在IGT组。在hrNGT组中的118个物种中，只有2个物种的丰度发生了显著变化，在IFG组中没有发生变化。然而在IGT组、CGI组和T2D组中，分别有20、98、27个物种的丰度发生了显著变化(大多呈下降趋势)(图3)。在验证队列证实，微生物特征丰度变化最多的是在CGI和T2D组，当以低危和高危联合NGT组为参照重新分析时，在118个物种中有11个在IFG组与联合NGT组之间具有显著性差异。然而，血糖状态改变与低危组或合并NGT组之间的总体变化规律相似，且IGT组与联合NGT组的变化更多。基于118个宏基因组物种的优势比分析显示，在发现队列或验证队列中，即使在调整了年龄、体重指数、性别和药物干预的影响之后，CGI/T2D组中61个物种的丰度也发生了显著变化(图3)。
与低风险NGT组相比，在前驱糖尿病和T2D组中发生改变的118种宏基因组物种中，有51种是潜在的丁酸酯产生菌（图3），而在这51个中有14个参与了基于微生物的分类器。大多数丁酸酯产生菌(分别在IGT组、CGI组和T2D组中为2, 36和5)的丰度有所下降(图3 cluster I，如Faecalibacterium spp., Clostridium spp., Alistipes spp.,Pseudoflavonifractor spp.以及Oscillibacter spp。然而，也有部分(IGT、CGI和T2D组分别为2、8和4个)的数量更丰富(图3 clusterII; 例如,Clostridium bolteae)。从两个丁酸盐产生菌中筛选的12种宏基因组物种之间的比较基因组分析（图3）显示，涉及DNA，RNA和蛋白质加工的第一类蛋白质比例升高，而氧化还原酶，毒力因子和转运蛋白的第二类蛋白质显著增多。以低高风险合并的NGT组作为参考重新进行分析时发现，在IFG组中有5个具有产丁酸潜力的物种的丰度下降(Flavonifractor plautii, Coprococcus eutactus, Alistipes obesi 以及Intestinimonasbutyriciproducens)。
此外，研究者还量化了来自碳水化合物（but和buk）和蛋白质（atoA / D和4hbt）中涉及丁酸生物合成的5个末端基因的相对丰度。研究发现，这五种基因的组合丰度在验证队列中的前驱糖尿病组和T2D组中均有所降低（图4A），对于4hbt / but也表现出相同的趋势（图4B）。此外，两组队列的CGI和T2D组的atoA / D丰度都显著降低（图4C），而buk的丰度则只在发现队列中的CGI组和验证队列的T2D组中有所降低（图4D），而上述组别是本研究中肠道菌群组成（图1A）和宏基因组种（图3）变化最大的组。
5 与血糖状态变化相关的微生物功能紊乱
与在IGT、CGI和T2D组中观察到的细菌组成变化同时，我们观察到潜在微生物功能的变化(图5A)。在发现队列中，该研究发现在IGT、CGI或T2D组中有3337个KEGG orthology groups (KOs)的相对丰度有显著变化，但与低风险NGT组相比，IFG组的KO丰度无显著变化。研究显示出最一致的下降趋势涉及到的46条途径（此处定义为两个队列中至少三个IGT，CGI和T2D组的显著下降）包括细菌甲烷生成，糖酵解，肽聚糖生物合成和万古霉素抗性以及DNA复制和转录（图5B）。此外，21个增加的途径包括两组分系统，磷酸转移酶系统，果糖和甘露糖代谢，磷酸戊糖途径，支链氨基酸的细菌生物合成以及B组维生素生物素和硫胺素的代谢（图5B）。该研究筛选出了与生物素代谢和合成相关的四种富集途径（图5B）。靶向KO分析表明，在发现和验证队列中的IGT，CGI和T2D组中，参与细菌生物素生物合成的7个关键KO中有6个显着富集。
图5 与血糖状态受损相关的微生物功能变化。(A) 左侧热图显示了3337个KOs的平均相对丰度，这些KOs在IGT、CGI或T2D组中至少有一个组与发现队列中的LrNGT组在丰度上存在显著差异(p<0.05；Wilcox秩和检验)。右侧热图显示与验证队列中的NGT组相比，IGT、CGI和T2D组中这3337个KOs的丰度发生了变化。(B) KEGG通路和模块富集分析显示了丰度变化最一致的通路(即，在来自两个队列的至少三个IGT、CGI和T2D组中，相对于lrNGT/NGT的显著变化)。显示丰度增加和减少的路径分别标识为红色和绿色圆圈，圆圈大小表示富集分数。
结论
在本研究中，研究者证明了肠道菌群的改变和T2D发病机制之间的密切联系。然而，先前发表的研究受限于样本量以及纳入了服用诸如二甲双胍等抗糖尿病药物的患者，这些药物自身对肠道微生物有很大的影响。此外，目前尚无研究针对不同的前驱糖尿病亚组内的微生物功能变化进行系统分析。为了研究在糖尿病前期和新确诊患者(以及未治疗的糖尿病患者)的肠道菌群是否发生改变，以及潜在的改变是否与临床变量相关，研究者使用宏基因测序来分析1011个有系列异常血糖反应的个体的肠道微生物(发现队列)，并验证了该研究的结果 (验证队列;n= 484)。该研究发现肠道菌群与糖耐量受损，合并糖耐量不耐受和T2D具有较强的协变性，并且独立于二甲双胍干预的影响，而肠道菌群的改变与胰岛素抵抗有关，但与空腹血糖无关。此外，该研究表明肠道菌群可以作为T2D的重要影响因素，并且与饮食因素密切相关。未来的研究应进一步关注在IGT和CGI患者中恢复微生物功能（例如丁酸生产）能否成为预防或延缓T2D进展的精确医学治疗策略。
评论
在这项基于人群的横断面研究中，研究者基于发现队列，发现在未接受糖尿病治疗的T2D患者中，其肠道菌群在组成和功能上发生显著变化，并且在验证队列中证实了这些结论。重要的是，该研究还表明，前驱糖尿病患者的肠道微生物已经发生一定改变，但在CGI患者中更明显，并且与胰岛素抵抗状态密切相关。 该研究发现的肠道菌群与前驱糖尿病和T2D之间的联系与之前的相关研究保持一致。此外，在该研究中，上述结果也独立于二甲双胍的使用，而二甲双胍是影响肠道菌群的主要混杂因素，并且也独立于他汀类药物和质子泵抑制剂以及其他混杂因素（例如年龄，性别和BMI）的治疗。此外，该研究分析显示，尽管IFG和IGT组的BMI相当，但IGG组和IGG组之间的差异与IGT组个体的菌群变化更为明显。因此，这项研究具有重要意义，因为早期研究报道，IGT/CGI患者比IFG患者患T2D和心血管疾病的风险更高。此外，更加重要的是, IGT和IFG已经被证明与外周及肝脏胰岛素抵抗有关。然而，本研究没有直接检测肝和外周胰岛素抵抗，因此不能排除肠道菌群在肝胰岛素信号传导中的潜在作用。
该研究进一步基于距离的冗余分析和基于微生物组的机器学习模型的结果进一步支持了肠道微生物群组成与胰岛素抵抗之间的联系，该模型用于区分CGI/T2D或NGT患者。值得注意的是，在发现队列中，CGI/T2D组群中微生物代谢产物丙酸咪唑的在外周循环中的水平升高，两个队列的CGI组中与支链氨基酸的生物合成相关的微生物丰度均有所增加，而丙酸咪唑和支链氨基酸都被证明通过mTORC1影响胰岛素信号转导，因此可以作为微生物和胰岛素抵抗之间潜在的因果联系。对肠道菌群功能的研究还表明，肠道菌群与饮食之间的潜在相互作用可能对T2D的形成十分重要。例如，IGT，CGI或T2D组的肠道菌群中细菌素生物合成的相关途径显著富集。一般情况下，细菌仅在环境生物素供应不足时才开始产生生物素，因此上述数据表明，在患有IGT，CGI或T2D的患者中可能缺乏生物素，而这种缺乏则会影响肠道菌群及其功能。尽管已经报道了T2D中会出现生物素缺乏症，并且一些相关研究也表明，补充生物素可以改善葡萄糖代谢。后续仍然需要进一步的研究来确定生物素缺乏症是否在T2D的发病机理和发展中发挥重要作用。
此外，该研究目前还存在一定的局限性。本研究中，出于安全考虑，T2D组中的大多数人仅根据空腹血糖进行诊断，而没有进行2小时口服葡萄糖耐量试验。鉴于T2D本身的高度异质性，这可能导致在两个队列中的T2D组之间存在微生物差异。此外，该研究并未将有IFG的组包括在验证队列中，也未将NGT组再分为低风险组和高风险组。最后，该研究是基于横断面的，因此仍然需要观察在纵向研究和不同种族背景的人群中进行进一步的随访。
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