科研 | Gut：肠道功能障碍通过细菌易位引起子痫前期的发展（国人作品）
编译：小范儿，编辑：小菌菌、江舜尧。
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子痫前期（PE）是使妊娠复杂化的恶性代谢疾病之一。肠道营养不良可引起代谢性疾病，但是肠道微生物组在PE发病机理中的作用仍然未知。文章通过16S核糖体RNA (rRNA)测序比较PE和正常妊娠孕妇的粪便微生物组，将粪便微生物菌群移植(FMT)应用于经抗生素处理的小鼠模型中。最后，通过16S rRNA测序、定量PCR和原位杂交，测定人和小鼠胎盘样品中的微生物组移位和免疫反应。
结果表明：PE患者细菌多样性降低，且存在明显的菌群失调。条件致病菌，特别是梭杆菌和韦荣球菌属富集，而有益菌，包括粪杆菌属和阿克曼氏菌在PE组中显著减少。这些细菌的丰度与血压(BP)、蛋白尿、转氨酶和肌酐水平相关。在成功的定殖过程中，PE患者的肠道微生物群引发受体小鼠妊娠前血压显著升高，妊娠后血压进一步升高；
此外，PE移植组表现蛋白尿增加、胚胎吸收和胎儿及胎盘重量降低，在小肠和脾脏Treg/Th17平衡被破坏以及更严重的肠泄漏。在PE和PE-FMT小鼠胎盘中，总细菌、梭杆菌和炎性细胞因子水平均显著升高。所以结果提示PE患者肠道菌群存在菌群失调，并参与了疾病的发病过程。
论文ID
原名：Gut dysbiosis induces thedevelopment of preeclampsia through bacterial translocation
译名：肠道功能障碍通过细菌易位引起子痫前期的发展
期刊：Gut
IF：17.943
发表时间：2020.01.03
通讯作者：黄丽萍
作者单位：南方医科大学南方医院妇产科
实验设计
结果
1. PE患者肠道菌群失调
本研究共纳入85例正常女性和67例PE患者。PE组有40例严重(PESF)， 27例无严重(PETSF)。根据是否在妊娠33周前发现本病，进一步将PE组分为早发组(21例)和晚发组(46例)。根据PCoA，使用未加权的UniFrac距离，PE组的肠道微生物组与NP组的肠道微生物组显着不同（图1A）。PE组的α-多样性指数显着降低（图1B，C）。PE患者和血压正常个体的肠道细菌群落由379个属组成，分别属于18个门。为了进一步确定PE组和NP组中哪些细菌类群是不同的，进行了LEfSe分析，确定7个有显著差异的属(图1D)。此外，PE患者的优势属梭菌属，杆菌属，韦荣球菌属，梭杆菌属的丰度比较显示，而毛螺菌属，阿克曼氏菌和粪杆菌属则被耗尽（图1E–K）。
通过重建未观察状态（PICRUSt）分析进行群落的系统发育调查，以推断微生物的代谢物和代谢途径。根据对所有参与者计算的Spearman相关性，这些关键属与血压、蛋白尿、肝功能损害或其他临床表现显著相关（图1L）。值得注意的是，韦荣球菌属和梭杆菌属与大多数临床参数显著相关，包括SBP、DBP、蛋白尿、水肿水平、丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、血清肌酐和白蛋白。拉克氏菌、阿克曼氏菌和粪杆菌的相关性正好相反。然而，仅在PE组检测时没有发现细菌与临床参数显著相关，这可能是由于样本量减少所致。这些结果揭示了PE组肠道菌群结构的显著变化，提示肠道微生物在PE发展中的重要性。
2. FMT诱导子痫前期表型。
为了进一步测试肠道菌群的改变是否会引起体内PE的发展，将PE患者的粪便微生物组移植到小鼠体内。进行抗生素治疗后，将受体小鼠随机分为几组，并用来自PE或NP供体的准备好的粪便内容物进行口服接种（图2A）。移植后6周，通过16S RNA测序分析受体小鼠的肠道微生物。PE-FMT小鼠与NP-FMT和对照组小鼠相比，妊娠前SBP明显升高。妊娠后，PE-FMT组的SBP值在妊娠第5天至妊娠结束时进一步升高（图2B）。除了加重高血压外，PE-FMT组在妊娠17天时尿蛋白浓度显著升高，而在交配前6周时尿蛋白排泄未发生变化(图2C)。与NP-FMT组和对照组相比，PE-FMT组的活仔数、胎重、胎盘重均有所下降，而胎重吸收率有所上升(图2D,E)。为确定PE患者的粪便细菌如何影响胎盘，我们检查了着床部位的结构。组织形态学分析显示，与NP-FMT组和对照组相比，PE-FMT组胎盘的两个功能胎盘区(迷路区和交界区)的比例增加，PE-FMT组胎盘的结构发生显著变化(图2F)。此外，PE-FMT组胎盘迷路形态差异明显(图2G)。PE-FMT小鼠出现梗死，胎盘迷宫层间质胶原沉积增加。然而，在NP-FMT组，迷宫形态与对照组相似。此外，肾脏组织未见明显的组织病理学异常。这些结果表明，类PE表型是由PE患者的粪便细菌转移引起的。
3. FMT诱发免疫失衡。
调节性T（Treg）细胞减少和/或T辅助17（Th17）细胞增加在PE的发病机理中起着核心作用。因此，研究FMT观察到的不良反应是否与Treg/Th17比例的变化有关。Treg和Th17细胞分别定义为共表达CD4+ CD25+ Foxp3+和CD4+ IL-17A+。每个受试者的Treg和Th17细胞数量以CD4+ T细胞百分比表示，并在不同组间进行比较。流式细胞术分析脾脏细胞和小肠固有层淋巴细胞发现，与NP-FMT组和对照组相比，PE患者在接受FMT治疗62天后，Treg细胞明显减少，Th17细胞明显增多(图3A-D)。此外，PE-FMT小鼠的Treg/Th17细胞比例低于NP-FMT和对照组小鼠（图3E）。进一步检查回肠中的炎症基因表达，以检测免疫反应的变化。如图3F所示，PE-FMT小鼠表现出明显高于NP-FMT或对照小鼠的IL-1β，Ccl3，Cxcl1和Vegf水平。总的来说，这些数据表明PE患者的粪便微生物群破坏粘膜和系统的免疫反应。。
图3.FMT诱导免疫失衡。
流式细胞术检测Treg和Th17细胞CD4+ CD25+ Foxp3+和CD4+ IL-17A+的共表达。每个受试者的Treg和Th17细胞数量以CD4+ T细胞百分比表示，并在不同组间进行比较。A-D. 测定了Th17细胞在siLPL和脾脏中的百分比，以及Treg细胞在siLPL和脾脏中的百分比。E. 三组的siLPL和脾脏中Treg/Th17细胞比例。F. 回肠中关键细胞因子和趋化因子的信使RNA水平。
4.PE患者菌群的FMT损害肠屏障功能。
已知肠内免疫反应受损与肠屏障功能障碍有关。调查PE患者的粪便细菌是否影响肠道屏障功能。通过粪便白蛋白含量监测肠道通透性，PE-FMT组明显升高（图4A）。FMT显著增加了PE-FMT小鼠的血浆内毒素水平（图4B）。此外，与NP-FMT或对照组小鼠相比，PE患者结肠中的粪便菌群降低Claudin4和Occludin基因的表达（图4C）。同样，免疫组化和western blot分析显示，结肠中形成屏障的紧密连接蛋白ZO-1和ZO-2、claudin-4和occludin蛋白水平明显降低（图4D-H）。此外，肠道菌群的丰度、肠道屏障和免疫指数之间存在显著的相关性（图4I）。这些数据表明，肠屏障被PE患者的粪便细菌破坏。
5. 细菌移位与胎盘炎症有关。
肠道通透性增加会导致肠道细菌或细菌成分转移到肠外组织中。通过定量PCR检测人和小鼠胎盘中的细菌，评估细菌16S rRNA基因。PE和PE-FMT胎盘中细菌总DNA的水平明显增加（图5A，C）。为了证实这些结果，使用针对细菌16S rRNA的探针EUB338进行ISH。用序列置乱探针处理的切片检测探针的特异性。在PE胎盘的绒毛组织和PE-FMT胎盘的连接层中可以看到更多的细菌信号。没有观察到混乱的探针对照的染色，但在EUB338探测的切片中检测到了染色（图5B，D）。
在实验过程中，通过在提取和扩增过程中添加无DNA水（从空白对照组和无模板扩增对照组提取DNA），以及在胎盘取样过程中添加无菌拭子（提取空白对照组）监测污染。如图5E所示，人和小鼠的胎盘宏基因组在聚类上与阴性对照明显不同。根据无污染的过滤数据，PCoA揭示PE和正常血压组以及NP-FMT和PE-FMT组的两个簇的显著分离（图5F，G）。促炎细胞因子和趋化因子被认为在PE的病理生理过程中起着重要的作用。接下来检查胎盘中趋化因子和促炎细胞因子表达的变化。尤其是与NP组相比，PE组的人胎鼠和小鼠胎盘中的IL-6，IL-1β，Ccl3或Ccl4信使RNA的水平均显著增加（图5H，I）。
图5.胎盘的细菌移位和炎症。
总细菌载量由正常胎盘和PE胎盘中16S rRNA的相对表达量表示。B. NP和PE胎盘中细菌的代表性原位检测。C. PE-FMT、NP-FMT与对照组小鼠胎盘总细菌载量的比较。D. 受体小鼠胎盘交界区原位染色的代表性图像。E. 所有样品的未加权UniFrac距离的PCoA，按样品类型着色。F-G. 基于未加权UniFrac距离的PCoA，比较PE和NP患者以及PE-FMT和NP-FMT小鼠之间胎盘样品的细菌群落结构。H. PE和NP胎盘关键细胞因子和趋化因子的mRNA水平。I. 小鼠胎盘中关键细胞因子和趋化因子的mRNA水平。
讨论
PE是妊娠期最严重的疾病之一，不仅会导致妊娠流产，而且会危及生命。由于该病的病因不明，缺乏有效的预测、预防和治疗方法。本研究旨在从肠道中寻求这些答案。研究发现PE患者的肠道菌群发生显著改变。因此，使用FMT，证明肠道菌群失调可以引起子痫前期系统。发生这种情况的一种可能机制是肠道屏障破坏和致病菌从肠道转移到胎盘，引起异常的免疫反应，因为患有PE的人和小鼠胎盘中总细菌和梭菌水平较高。研究表明，“肠道-胎盘”轴可能在理解体育的病因中起着至关重要的作用。
研究中观察到PE肠道菌群失调明显，与之前报道的结果一致。由于人类肠道微生物组在个体之间具有高度异质性，因此在无监督学习下进行分析时，健康和患病个体的微生物群通常与部分分化重叠。然而，在本研究中，PE肠道菌群与对照组明显不同，几乎没有重叠，提示PE患者存在严重的菌群失调。更有趣的是生态失调模式，如在PE中粪便杆菌和阿克曼氏菌被耗尽，而梭杆菌和韦荣球菌属被富集。与非妊娠高血压患者的微生物群特征相似，PE患者中消耗了产生肠道上皮营养，维持免疫稳态和增强肠道屏障功能的粪杆菌属和阿克曼菌。梭杆菌和韦荣球菌属主要是条件致病菌，与慢性炎症和不良妊娠结局有关。此外，Liu等人发现，这些细菌在美国和华南地区的PE患者肠道中发生了变化，表明PE的生态失调模式在人群和地区之间是一致的。因此，我们的研究报道的PE的失调模式是可靠的。
梭杆菌可能是PE中肠-胎盘轴的关键调节因子。PE中梭杆菌的富集尤其值得关注，因为它是一种新发现的促进结直肠癌发生的关键病原体。所涉及的机制包括，梭杆菌通过黏附上皮细胞而影响细胞凋亡、细胞增殖和DNA修复，并通过NF-κB信号通路激活免疫反应。换句话说，梭杆菌尤其擅长破坏肠道上皮，导致肠道渗漏。肠道渗漏的一个可能后果是细菌移位，因为已经在患PE的女性和小鼠的胎盘中发现了更多的细菌和梭杆菌。此外，Amarasekara等人还发现PE胎盘中梭杆菌数量的增加，可能会侵入内皮细胞，引起局部炎症。胎盘微生物群的存在是争论的焦点。然而，我们的观点是细菌可以在病理条件下进入胎盘，这是最近的研究支持的。此外，在胎盘取样时小心地保持无菌条件，并使用对照来监测污染。虽然目前还不能从理论上排除污染的可能性，但未来以梭杆菌为重点的研究有助于深入了解PE期间的肠-胎盘轴。
母体炎症过度，常因Treg/Th17失衡而参与PE发病，也认为是肠道菌群失调的结果。在本研究中，PE-FMT小鼠表现为Treg和Th17细胞的粘膜和系统失衡，胎盘炎症反应加剧。增加炎症细胞因子，导致胎盘氧化应激和血管功能障碍，导致胎儿排斥反应和高血压的发生。我们发现PE肠道菌群失调可使宿主的血压升高，是PE的主要表现之一。据报道，肠道菌群在怀孕时发生改变，因此，我们推断，在某些情况下，妊娠期的异常状态会导致血压升高，从而导致PE。这一推论为PE病因学提供了一个新的视角，需要进一步的研究。有趣的是，接受PE患者粪便的小鼠在妊娠前就出现血压升高，提示肠道菌群失调的高血压效应与妊娠无关。也不清楚为什么有些妇女在怀孕期间会有这种倾向于PE的生态失调。例如，是否由于激素的变化或饮食的改变而发生的失调需要在未来进行研究。
结论
该研究发现PE患者明显的肠道菌群失调，并使用FMT证明这种菌群失调可以引起子痫前期系统。可能的潜在机制是，失调影响宿主的血压，肠道梭杆菌移位到胎盘，引起局部胎盘炎症。对早期妊娠妇女进行队列研究，观察她们的微生物群落动态、血压变化和PE的发生，将为肠道微生物群落与PE的联系提供重要证据。揭示了肠-胎盘轴在PE中的作用，为PE病因学提供了新的见解。
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