科研 | ES&T：银纳米颗粒可改变未种植土壤和黄瓜种植土壤中微生物的群落组成和代谢谱（国人作品）
编译：小太阳，编辑：小菌菌、江舜尧。
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纳米技术的飞速发展使得环境影响评价成为确保工程纳米材料可持续利用的必要举措。本研究中，向未种植土壤和黄瓜种植土壤中加入浓度为100 mg/kg的银纳米颗粒（AgNPs），暴露时间为60天。分别通过16S rRNA基因测序和基于气相色谱-质谱（GC-MS）技术的代谢组学技术来评估土壤微生物群落和相关土壤代谢产物的响应。
结果显示，AgNPs暴露均会显著提高未种植土壤和黄瓜种植土壤中的pH值。经过银暴露后，两种土壤中细菌的群落结构均发生变化。与碳、氮和磷循环相关的几个功能上较为重要的细菌类群，在未种植和黄瓜种植的土壤中均受到银纳米颗粒影响。通常来讲，植物在调节AgNPs对细菌群落结构的影响方面的作用是有限的。土壤代谢组学分析表明，AgNPs均改变了未种植和黄瓜种植土壤中的代谢轮廓。发生显著变化的代谢物主要涉及糖和氨基酸相关的代谢通路，这表明碳和氮代谢发生紊乱，这一结果与细菌群落结构的变化结果一致。此外，AgNPs暴露导致未种植土壤和黄瓜种植土壤中几种脂肪酸均出现显著降低，表明AgNPs暴露可能对微生物细胞膜施加了氧化应激。以上这些结果为理解AgNPs暴露对植物和土壤微生物群落的生物学和生化影响提供了有重要的信息，但仍需开展更多的研究以进一步了解这些材料给环境带来的风险。
论文ID
原名：Silver Nanoparticles Alter Soil Microbial Community Compositions and Metabolite Profiles in Unplanted and Cucumber-Planted Soils
译名：银纳米颗粒可改变未种植土壤和黄瓜种植土壤中微生物的群落组成和代谢谱
期刊：Environmental Science&Technology
IF：7.149
发表时间：2020.2.24
通信作者：季荣，赵丽娟
通信作者单位：南京大学
实验设计
供试的农用土壤取于中国科学院海伦农业生态实验站（东经126°38′，北纬47°26′）。采集顶部约20 cm深的土壤并进行风干处理，然后过2mm筛。制备AgNPs储备溶液：将1000 mg AgNPs分散在1 L去离子水中，在冰浴环境下以50 kHz的频率进行超声处理60 min，以得到分散均匀的溶液。四种处理方法如下：土壤（A）；土壤+ 100 mg / kg AgNPs（B）；土壤+植物（C）; 土壤+植物+ 100 mg / kg AgNPs（D）。每种处理均设置4个重复。为使土壤中AgNPs含量达到100 mg/kg，首先在容器中加入100 g土壤，然后加入10 mL AgNPs储备液和40 mL去离子水。加入AgNPs 12 h后，将黄瓜（C. sativus，中农28 F1号）种子播种到土壤中（深度为1 cm）。在25 °C条件下培育7天，然后将所有盆中的黄瓜削减至每盆1颗。然后将幼苗置于温室中培养60天，设定昼夜温度为28/20 °C，光照周期为18/6 h。温室的相对湿度和照度分别为60％和180 μmol/（m2 s）。在幼苗生长期间，根据需要进行浇水且不额外施用肥料。
结果
1 AgNPs对土壤化学性质的影响
土壤经AgNPs暴露60 天后，对土壤中溶解性有机质含量、pH值和生物可利用元素进行评估。结果显示AgNPs暴露显著增加了土壤pH值，在未种植土壤中，pH值从 5.28升至 5.33，在种植土壤中，pH值从5.18 升至 5.26。有研究表明，添加低分子量化合物（例如苹果酸、柠檬酸和甘氨酸）会导致土壤pH值显著升高。AgNPs暴露可能会改变土壤中代谢物的组成，进而导致土壤pH值升高。不论植物是否存在，AgNPs暴露均不会改变土壤中溶解性有机质的含量。考虑到土壤pH值的升高，推测土壤中的水溶性元素可能会减少。然而，在黄瓜种植土壤中，被测元素的生物利用度因AgNP的存在而显著增加。如K、Na、Mg和Si等宏观元素以及如Al、Cu和Cd等微量元素均显著增加（表1）。虽然AgNPs对这些元素的干预机制尚未明确，但可以推测这可能与土壤微生物群落结构和代谢组的变化有关。
2 未种植土壤中微生物群落对AgNPs的响应
为确定土壤微生物群落对AgNPs暴露的响应，本研究借助于Illumina MiSeq平台进行了高通量土壤细菌16S rRNA基因测序。数据显示，在对照组土壤和AgNPs暴露组土壤中，变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）均为优势菌种。但是，PCoA结果表明，AgNPs暴露改变了土壤细菌的群落结构，从Anosim测试结果来看，这一变化非常显著（p = 0.035）。Sobs指数是每个样本中观察到的不同OTU的数量，常用于估计微生物群落的丰富度。如图1所示，与未改良的对照组土壤相比，AgNPs暴露导致每个分类水平的土壤细菌群落的丰富度均出现显著增加。已有文献报道，在AgNPs暴露下，土壤细菌群落丰富度增加。特别是，如亚硝酸弧菌属（Nitrosovibrio）、硝化螺菌属（Nitrospira）和慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）等与氮循环相关的细菌类群经AgNPs暴露出现显著增加。据报道，土壤微生物组可以通过改变微生物组成以响应AgNPs诱导的胁迫，包括改变某些耐银菌属，如Rhodanobacter sp.和Luteobacterrhizovicinos.。显然，其他因素也可能会增加AgNPs暴露后细菌群落的丰富度，但这需要进一步研究以探明这些变化的潜在机制及其作用。
这并不奇怪，AgNPs暴露抑制的菌属较多，而增加的菌属较少（图 2I）。例如，Chitinophagales和 Chitinophagaceae的相对丰度经AgNPs暴露后出现下降（图2I）。据报道，Chitinophagales 和 Chitinophagaceae能够降解几丁质并水解纤维素。此外，与杂多糖水解（芽孢杆菌）相关的微生物类群的相对丰度也出现下降（图2I）。另外，AgNPs暴露对另一类菌属Propionibacteriales也存在负面影响，Propionibacteriales可通过发酵葡萄糖而产生乳酸、丙酸和乙酸。已知拟杆菌能够降解高分子量化合物，例如蛋白质和多糖等。AgNPs暴露也导致了该菌属相对丰度的降低（图2I）。由于与碳循环相关细菌群的相对丰度发生了变化，所以可知AgNPs暴露可能会对土壤微生物组的糖和有机酸代谢产生负面影响，并随后对碳转移、代谢、储存和土壤有机碳库的组成产生潜在影响。尽管这些作用的确切机制尚不清楚，但众所周知，AgNPs释放的Ag+对微生物具有毒性效应。
同时，AgNPs暴露也对土壤中许多与氮循环相关的微生物群产生了负面或正面的影响。例如，Frankiales是一种土壤放线菌，可以与许多植物建立共生关系，其相对丰度经AgNP暴露后出现显著降低（图2I）。但是，另一种与氮固定相关的细菌Bradyrhizobium的相对丰度经AgNPs暴露后出现显著增加（图2I）。之前的研究发现，即使在0.0625 mg / kg AgNPs暴露下，慢生根瘤菌也会出现增加，这一发现与本研究结果一致。此外，AgNPs暴露会增加另一种与氮循环有关的微生物Arenimonas的相对丰度（图2I）。Arenimonas是一种典型的异养反硝化细菌，可将硝酸盐还原为氮。此外，酸杆菌门（Acidobacteria）具有碳消耗、氮同化及其他的重要功能，且该菌属丰度经AgNPs暴露后出现降低。除了与碳和氮循环相关的细菌外，AgNPs暴露还对在环境中磷酸盐循环起作用的生物产生影响。 AgNPs暴露分别导致索力氏菌纲（Solibacterales）和芽单胞菌属（Gemmatimonas）的相对丰度出现显著降低和显著增加（图2I）。索力氏菌纲（Solibacterales）对于磷的生物累积、无机磷的增溶以及有机磷的矿化具有非常重要的作用。同样值得注意的是，AgNPs暴露也对涉及生物和非生物胁迫耐受性的微生物存在影响。黄色单胞菌目（Xanthomonadales)和黄色单胞菌科（Xanthomonadaceae）的相对丰度经AgNPs暴露后出现显著增加（图2I）。此外，伯克氏菌科（Burkholderiaceae），是一种在抑制土壤传播病原体中发挥有益作用的细菌，其相对丰度出现降低（图2I）。有报道称，伯克氏菌科（Burkholderiaceae）成员能够产生多种具有抑制真菌活性的代谢产物。最近，有研究人员发现，伯克氏菌科（Burkholderiaceae）成员会产生抗真菌代谢物-含硫挥发性化合物。
AgNPs暴露后，还出现了其他值得注意的变化，例如，与污染物降解相关的微生物出现减少，如类诺卡氏菌科（Nocardioidaceae）、鞘脂单胞菌目（Sphingomonadales）和芽生球菌属（Blastococcus）（图2I）。例如，类诺卡氏菌科（Nocardioidaceae）可以降解多种有机化合物，包括芳香族和多芳香族污染物以及有毒化学物质。据报道，鞘脂单胞菌目（Sphingomonadales）和鞘脂单胞菌科（Sphingomonadaceae）可有效降解受污染土壤中的多环芳烃（PAHs）。
总而言之，AgNPs暴露改变了参与碳、氮和磷循环、病原抗性和污染物降解的菌群的相对丰度。仍需要开展进一步的研究以确定土壤生态功能是否受到影响，如碳、氮和磷库以及土壤是否更易受病原体扩散的影响。
3 黄瓜种植土壤中微生物群落对AgNPs的响应
在黄瓜种植土壤中，优势菌种与未种植土壤中一致，主要为变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）。由Anosim测试的结果可知，与对照组相比，在黄瓜种植土壤中，AgNPs暴露显著（p = 0.034）改变了土壤微生物的群落结构。结合未种植组的数据来看，本研究结果表明，不管植物存在与否，AgNPs暴露均会显著改变土壤微生物的组成。有趣的是，在黄瓜种植土壤中，经AgNPs暴露后，各个分类水平（从门到属）的土壤微生物群落丰富度（sobs指数）均出现显著降低（图1），这与未种植土壤的分析结果相反。这可能是由于在植物存在时，土壤微生物对AgNPs暴露的响应发生了变化，然而这种生物相互作用的机制还尚未明确。
与未种植土壤类似，AgNPs暴露导致黄瓜种植土壤中微生物分类群发生了许多变化。实际上，在植物存在的情况下，AgNPs诱导了类似的微生物变化模式，主要包括酸杆菌门（Acidobacteria）、索力氏菌纲（Solibacterales）、Bryobacter、 Chitinophagales、Chitophagaceae和索力氏菌科子-群3(Solibacteraceae_Subgroup_3）出现下调，黄色单胞菌科（Xanthomonadaceae）、黄色单胞菌目（Xanthomonadales）、芽单胞菌属（Gemmatimonas）、单胞菌属（Arenimonas）和慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）出现上调（图2II）。如上所述，这些微生物主要参与土壤中的碳、氮和磷循环。由此推断，AgNPs暴露也可能会影响黄瓜种植土壤中碳、氮和磷循环。这表明，植物对于减轻AgNPs暴露引起的土壤微生物群落变化的作用是有限的。这些发现与之前的报道有所不同，之前的研究发现大豆植株可以减轻CeO2和ZnO NP对土壤细菌群落的毒性。值得注意的是，鞘脂单胞菌目（Sphingomonadales）和鞘脂单胞菌科（Sphingomonadaceae）可能是个例外。在未种植土壤中，AgNPs暴露显著降低了这些细菌群的相对丰度，但在黄瓜种植土壤中，AgNPs暴露则显著增加了这些细菌群的相对丰度（图2II）。如上所述，植物可通过多种途径轻易的改变土壤微生物，包括将生物活性分子分泌到根际中等。
有趣的是，有几种微生物类群仅在种植土壤中出现了丰度变化。这些菌属主要包括绿弯菌门（Chloroflexi phylum）（厌氧绳菌纲（Anaerolineae）和绿弯菌目（Chloroflexales））、变形杆菌纲（Deltaproteobacteria class）（粘球菌目（Myxococcales））和 Pyrinomonadales目。经AgNPs暴露后，它们的相对丰度出现显著降低（图2II）。绿弯菌门（Chloroflexi phylum）是一个大的门，涵盖具有各种代谢特征的细菌。其中，厌氧绳菌纲（Anaerolineae）在碳水化合物发酵（例如纤维素水解）方面表现出显著的代谢能力。绿弯菌目（Chloroflexales）由具有细菌叶绿素(BChl)的光合异养菌组成。此外，变形杆菌纲（Deltaproteobacteria class）具有多种功能，包括降硫、多环芳烃（PAHs）的厌氧降解和铁还原等。粘球菌目（Myxococcales）属于变形菌纲，且已知该菌可以分解可降解的聚合物。另外，Pyrinomonadaceae科优选含有蛋白质的底物，并且能够水解复杂的聚合物，例如纤维素、淀粉和木聚糖等。因此，这些微生物的减少，表明在植物存在下，AgNPs暴露可能会对土壤中碳水化合物的代谢和污染物的降解产生负面影响。土壤微生物组，尤其是根际微生物组，由于其与养分获取、防御病原体感染和胁迫耐受性有关，所以对植物的生长产生了深远的影响。AgNPs暴露引发的土壤微生物群落的重大转变可能会严重威胁植物的新陈代谢、生长和对病原体的抵抗力。
4 未种植土壤中代谢产物对AgNPs的响应
土壤中的AgNPs可能与土壤微生物直接或间接发生相互作用，并随后影响土壤微生物组的代谢。土壤微生物分泌的细胞内和细胞外的代谢物促成了土壤代谢物库。因此，监测土壤代谢物可以间接反映微生物代谢过程的变化。为此，本研究开展了基于GC-MS的非靶向代谢组学分析，在土壤样品中总共鉴定出272种代谢物并将进行了半定量分析。运用 PLS-DA 模型对对照组和AgNPs暴露组的数据信息进行处理，模型显示未经AgNPs暴露的土壤（A）和经AgNPs暴露的土壤（B）可以明显的区分开。这表明AgNPs暴露会显著改变土壤的低分子量代谢物的轮廓。由于土壤中的代谢物主要来自微生物，因此结果表明，AgNPs可能会改变土壤微生物组内的代谢过程。根据VIP> 1.5，在土壤中鉴定出20种发生显著变化的代谢物（图3I）。如图3I所示，除了少数几个代谢物发生上调外，大多数代谢物经AgNPs暴露后均出现下调。这表明AgNPs暴露通常对土壤微生物的代谢产生负面影响。
值得注意的是，经AgNPs暴露后，许多脂肪酸及其前体物质含量显著降低，包括十五烷酸、棕榈油酸、亚油酸、棕榈酸、十七烷酸和油酸（图3I）。微生物自身产生多种链长和组分不一的磷脂脂肪酸（PLFA），以使其在直接接触的环境中维持细胞膜完整性和细胞功能。磷脂脂肪酸轮廓的改变可能是由于AgNPs诱导生成了过量的ROS，它可以使微生物细胞膜上的脂肪酸发生氧化。也有可能是，微生物群落中的菌属通过调节膜中的磷脂脂肪酸以响应AgNPs诱导的胁迫。另一方面，磷脂脂肪酸可用于估算土壤中的活生物量，因为磷脂脂肪酸作为细胞膜的成分可以在细胞水解过程中迅速降解。磷脂脂肪酸水平降低可能表明AgNPs暴露降低了微生物生物量。发生改变的磷脂脂肪酸轮廓也可能是由于不同的微生物的存在导致的。
其他显著变化主要体现在几种特定的糖和氨基酸的含量。在AgNPs存在时，半乳糖醇、1,5-脱水葡萄糖醇、果糖-1-磷酸、肌醇、葡萄糖-1-磷酸、N-乙酰基-D-甘露糖胺、酮己糖、高丝氨酸、半胱氨酸-甘氨酸和亮氨酸均在土壤中出现显著减少或增加（图3I）。半胱氨酸和甘氨酸都是谷胱甘肽的组成成分，而谷胱甘肽则是微生物中的重要抗氧化剂。半胱氨酸-甘氨酸的上调可能表明土壤微生物群落中某些成员的抗氧化防御系统被激活。经AgNPs暴露后，根际土壤中的木糖酸内酯减少。D-木糖酸内酯是脱氢酶的直接产物；每微生物生物量碳含量的脱氢酶活性已用于评估微生物的代谢活性。木糖酸内酯的减少可能表明微生物脱氢酶活性受到损害。此外，经AgNPs暴露后，多糖N-乙酰基-D-甘露糖胺显著降低。众所周知，微生物的生物膜由蛋白质和多糖组成，在细菌群落的形成中起着重要作用，并有助于维持其结构和功能。该多糖和其他多糖的下调可能再次表明AgNPs对土壤碳循环的负面影响。
生物代谢路径的分析结果显示，有5个微生物代谢途径发生了显著改变，包括氨基糖和核苷酸糖代谢、淀粉和蔗糖代谢、糖酵解/糖异生、嘧啶代谢和谷胱甘肽代谢。重要的是，所有这些途径都与碳代谢相关。这表明AgNPs暴露显著影响了微生物的基础代谢过程，特别是碳代谢。这一结果与先前的报道一致，即AgNPs可能影响土壤微生物的代谢，从而改变碳和氮循环。总体而言，以上结果表明，土壤代谢组学可以揭示有关土壤微生物群落如何在分子水平上AgNPs或其他外源性物质作出反应的重要信息，包括毒性机理和随后的排毒策略。
5 黄瓜种植土壤中的代谢产物对AgNPs的响应
植物不断向根际分泌大量的代谢产物。在植物存在的情况下，土壤代谢物库由植物分泌的代谢物和微生物群落的外源性代谢物组成。结果表明，AgNPs暴露也改变了黄瓜种植土壤中的代谢产物轮廓。分析结果显示，土壤＋植物＋AgNPs组可以与土壤＋植物组明显的区分开。这表明经AgNPs暴露后的根际代谢组与对照组差异较为明显。值得注意的是，有一些代谢产物与未种植土壤中的代谢产物重叠。例如，在黄瓜种植土壤中也观察到脂肪酸（棕榈酸、棕榈酸、十七烷酸和油酸）出现显著降低（图3II）。这表明AgNPs对微生物膜的负面影响不会因植物的存在而发生改变。换句话说，植物根系分泌物不会显著改变AgNPs对土壤微生物的负面影响。重要的是，有一些代谢变化仅在黄瓜种植土壤中出现，主要体现在1-蔗果三糖、羊毛甾醇、果糖-1-磷酸、槐糖和葡萄糖的水平升高，木糖醛酸、富马酸、左旋葡聚糖、γ-氨基丁酸酸（GABA）、瓜氨酸和β-丙氨酸水平下降（图3II）。这表明AgNPs暴露显著改变了根系分泌物的组成。这些变化的根本机制，包括它们是否由植物调节，或者这些变化是主动的还是被动的，目前还尚未明确。植物向根际释放出多种物种特异性的低分子量化合物，这些生物活性化合物会影响根际微生物组的活性和组成。在未种植的土壤中，AgNPs暴露将直接影响微生物群落。但是，在黄瓜种植土壤中，根系分泌物组成的变化也可能会间接影响微生物群落。
我们评估了AgNPs暴露对黄瓜植物生物量、MDA含量（即脂质过氧化）和抗氧化剂含量的影响。AgNPs显著降低了黄瓜组织（根、茎和叶）的生物量，这表明AgNPs具有明显的植物毒性。结果表明，经AgNPs暴露后叶绿素含量没有变化。但是，AgNPs暴露显著（p <0.01）升高了黄瓜叶片中MDA的水平，这表明叶片中发生了脂质过氧化。经AgNPs暴露后，黄瓜叶片中的总酚类（抗氧化剂的一种成分）显著增加（p <0.01）。 MDA水平和总酚含量的升高表明，AgNPs诱导黄瓜植株出现氧化应激。我们之前的研究发现，叶面施用AgNPs可诱导黄瓜植株的发生氧化应激。具体而言，从AgNPs释放的Ag+导致了ROS的过度生成，而这可能会导致植物出现氧化应激。
6 植物可吸收或释放代谢产物到土壤中吗？
众所周知，植物通过根系分泌物将光合作用固定的约11-40％的碳释放到根际中。因此，与未种植土壤相比，存在植物的土壤的代谢产物量可能更高。为了区分植物根部释放的代谢物，通过PLS-DA模型分析了A组（土壤）和C组（土壤+植物）的数据。意料之中，根际和未种植土壤的代谢产物分布显著不同。如图3III所示，在植物存在下情况下，几乎所有代谢产物均显著增加。这一结果符合我们的预期，即植物释放的代谢物比土壤微生物释放的低分子量化合物更多。从VIP得分（图3III）可以看出，有机酸（木糖醛酸、柠檬酸、2-羟基戊酸和3-羟基苯甲酸）、糖（槐糖、果糖-1,6-双磷酸、葡萄糖-1-磷酸、左旋葡聚糖和异麦芽糖）、脂肪酸（油酸和亚油酸）和氨基酸（GABA、缬氨酸、亮氨酸、脯氨酸、苏氨酸、丙氨酸和异亮氨酸）贡献很大。这些代谢物为土壤微生物群落提供了丰富的碳和能量来源。
7 对环境的影响
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