本研究数据来源于商业科学健康计划(Arivale公司，见方法)中的3409名参与者，包括59%的女性，84%为欧洲裔美国人，平均年龄为49±12岁，平均体重指数为27±6公斤/平方米(表1)。所有参与者都完成了生活方式、压力、消化和饮食问卷，90% (n=3064)的参与者进行了65项临床实验室血液检测(补充数据1)。通过对所有参与者的16S扩增子测序来确定粪便样本的肠道微生物组成(参见方法)。
表1 个人人口统计摘要。
2 微生物多样性与拟杆菌门到厚壁菌门轴密切相关
研究参与者的肠道微生物组的总体组成，厚壁菌门的相对丰度在约6%至约100%的范围内，而拟杆菌门的相对丰度在约0%至约90%的范围内(图1)。我们观察到香农多样性与拟杆菌的相对丰度呈强负相关(r= 0.67，P < 1015，Pearson’s correlation)，然而并非线性相关，并且显示出与拟杆菌的最低水平呈正相关。这种非线性趋势也在其他多样性指标中观察到，如皮埃罗均匀度指数、物种丰度和费思系统发育指数(见补充图1)。总体而言，当拟杆菌门和厚壁菌门的相对丰度分别为~15%和~80%时，香农多样性最大化(补充图2；参见方法)。此外，Proteobacteria、Fusobacteria和TM-7与多样性显著负相关(r = 0.18，P < 1015；r = 0.13，P < 1 0 13；r = 0.10，P < 1.08)，而Tenericutes、Euryarchaeota、Lentisphaerae和Cyanobacteria与多样性显著正相关(r= 0.28，P < 1.015；r=0.19，P < 1 0-15；r= 0.17，P < 1 0 15；r=0.13，分别P < 1 0 13)。
图1 参与者肠道微生物群的总体组成。显示了所有参与者样本的香农多样性指数(a)和门相对丰度(b)。每一个样品都由底部(b)中的一个堆叠的条形表示，用phyla着色，上部(a)中的一个对应点表示微生物的多样性。
为了确定其他分类群相对丰度和多样性之间的相关模式(由于拟杆菌门是与多样性最相关的门)，我们重新检查了分类群和多样性之间的相关性，同时考虑了拟杆菌门的丰度。为此，我们将拟杆菌调节多样性定义为拟杆菌丰度多样性非线性回归的残差(见方法)。我们发现放线菌门与未调整的香农多样性呈轻微正相关(r=0.04，P= 0.02)，是与BA多样性呈最大负相关的门(r = 0.21，P < 1 015)，双歧杆菌属和埃格氏菌属与BA多样性呈最大负相关 (r = 0.04，P < 1 015；r = 0.20，P < 1 0 15)。值得注意的是，虽然双歧杆菌被认为是有益的肠道细菌属，但Eggerthella (特别是E. lenta)为机会性病原体。
为了检查驱动参与者肠道微生物组分类差异的主要因素，我们应用了edgePCA28主要成分分析，用于解释系统发育(图2)。第一个基于分类法的主成分(PC1解释约54%的方差)与厚壁菌门和拟杆菌门的丰度密切相关(图2b)，而第二主成分(PC2解释约17%的方差)与类杆菌属的丰度高度相关(图2c)。然而，我们并未发现明显集群，而是发现了从总体类杆菌非常低的水平到普雷沃氏菌或类杆菌高水平的组成的连续体(图2a)。如先前的研究，发现富含普雷沃氏菌和类杆菌的组合物相对不重叠。
图2 肠道微生物组分类组成的主成分分析。图中所示为通过对OTU水平计数数据应用边缘主成分分析生成的主成分分析图。每个点代表一个样本，样本用其香农多样性指数着色。每个轴上描绘了由每个主成分解释的变化百分比。b +c所示为拟杆菌门和厚壁菌门(b)以及拟杆菌属和普雷沃氏菌属(c)在相应主成分上的相对丰度散点图。对于(a)中的每个样本，(b)中有两个对应点，(c)中有两个对应点。线条表示loess回归拟合，阴影区域表示95%的置信区间。N=3409表示生物独立样本数。
将分析扩展到第三和第四主成分(PC3-4；分别解释约5%和约3%的方差)，我们发现梭菌目(厚壁菌门)的不同分支与这些分支密切相关(补充图3)。具体而言，粪肠球菌属(梭状芽孢杆菌科)与PC3呈负相关，而拉克氏菌科和乳球菌科分别与PC4呈负相关和正相关。结果表明，在厚壁菌门丰度增加的连续体中，这三个分支的组成趋于变化。有趣的是，双歧杆菌属放线杆菌，是有益的共生体属，与PC3正相关。将结果与应用非计量多维标度(NMDS)获得的结果进行比较加权UniFrac或Bray-Curtis距离，发现类似结果，尽管edgePCA的主要成分与主要分类驱动因素的相关性比Bray-Curtis或基于UniFrac的NMDS的主要坐标更好，突出了使用微生物组特异性排序技术的好处(见补充图4-5)。3 多种生活方式和临床因素与肠道微生物多样性相关。临床因素与肠道微生物多样性相关。我们接下来开始确定哪些宿主因素与肠道微生物群的多样性有关。在我们检查的148个生活方式和临床因素中，75个与香农多样性显著相关(图3和补充数据2；参考方法)。已识别的42种血液临床标志物与微生物群多样性相关的标志物，如糖尿病(空腹胰岛素，P < 1012)、炎症(hs-CRP，P < 1014)、肝功能(ALAT，P < 109)和胆固醇(低密度脂蛋白，P < 1016)。此外，发现ω-3脂肪酸与鱼摄入量有关的标记物，如二十二碳六烯酸和汞，与多样性呈正相关(P < 1013；p < 1 0 14；p < 1 0-16)。体重指数、体重和血压与多样性显著负相关，而身高与多样性显著正相关。对于测量的生活方式因素，我们发现了身体活动和微生物多样性之间联系的有力证据，身体活动的频率(即每周天数)和持续时间与微生物多样性正相关。多吃水果、蔬菜和十字花科蔬菜与多样性呈正相关，而增加含糖饮料摄入与多样性呈负相关。最后，肠道健康状况指标，如每周腹泻、恶心和胃酸反流的频率，与微生物多样性呈负相关(参见补充数据2中的完整关联结果列表)。最近的动物研究和小规模病例对照人体研究表明，运动和肠道微生物群组成之间存在关系，但这种关联在人群水平上的稳健性仍不确定。在这里，我们确定微生物多样性和适度体力活动和剧烈的体力活动有关(图3；MPA和VPA分别为P < 1015和P < 1015)。由于许多宿主因素是相互关联的，我们试图了解与体育活动的关系是否独立于其他健康的生活方式习惯。因此，我们调整了饮食因素，如每周水果、蔬菜、全谷物和含糖饮料的摄入量，并发现这种关联仍然显著(精神创伤和痛苦，VPA分别为P < 105和P < 1015)。当体重指数作为一个额外的协变量时，剧烈体力活动的相关性仍然显著(对于精神创伤和痛苦以及VPA，P= 0.08和P= 0.04)。因此，我们的结果揭示了在人群水平上，身体活动和微生物多样性之间的密切关系，这种关系与主要的饮食因素和体重指数有关。
图3 微生物多样性和多种因素之间的显著联系。图中显示的是一个条形图，代表所有可用样本的香农多样性由每个因子(y轴)解释的方差百分比(x轴)。正值表示积极的联系，负值表示与多样性的消极联系。每一个因素都是由它所属的类别决定的。对于每种分析物(例如，生活方式、饮食、临床试验)，通过拟合线性回归模型(见方法)来测试关联性，并且仅显示通过For多重假设校正且p< 0.05的因素。
4 不同组成簇内宿主因子和微生物多样性之间的关联。
在不同的微生物组组成状态下微生物组多样性和宿主因素之间的联系有所不同，我们定义了四个群:具有平均相对丰度水平的厚壁菌门参考群，厚壁菌门丰度群，类杆菌丰度群和普雷沃氏菌丰度群(见方法和补充图6)。与在平均厚壁菌门群(作为参照组)中发现的关联相比，我们分别在厚壁菌门、类杆菌和普雷沃氏菌的群中发现了0、14和14个独特的关联(经FDR校正后p< 0.05，补充数据3)。例如，我们发现胰岛素水平和微生物群多样性之间的关联在富含拟杆菌的群中比在参考群中更显著(p < 106)，并且每天食用的蔬菜数量与富含普雷沃氏菌群中的微生物群多样性之间的关联比其他微生物群组成群中的显著更正(p < 104，F i g . 4)。5 宿主因素通过其与微生物群的关联模式聚集成健康和疾病相关组。探索宿主因子和单个属之间的关系，并推断功能途径。经过基因突变率校正后，我们在142个宿主因子、102个细菌属和274个细菌代谢途径中发现了超过1500个显著关联(见方法)。我们发现，宿主因子通过其微生物组关联模式聚集成两大组(图5)。第一类是与健康相关的群体，其中宿主因素的较高值或生活方式行为节奏的增加通常与更好的整体健康相关，包括临床实验室测量(例如，维生素D、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白颗粒大小、ω-3指数和脂联素)；饮食因素(例如，水果和蔬菜的摄入)；活动因素(如体力活动)；和消化因素(例如，排便通畅性)。第二种是与疾病相关的群体，其中宿主因素的较高值或生活方式行为节奏的增加通常与较差的整体健康相关，包括BMI糖尿病标志物(如HOMA胰岛素抵抗、胰岛素、葡萄糖、糖化血红蛋白)；心血管风险因素(如低密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯和血压)；炎症风险标志物(如CRP-HS、IL-6)；和不良消化症状(例如腹泻、胃酸倒流)。每一组都与不同的属高度相关。为了了解与单个分类群的关联是代表独立的关联还是反映微生物组中更全面的组成变化，我们重复了上述分析，但这次也调整了我们模型中的香农多样性。发现，在对多样性进行调整之前，乳球菌科和梭状芽孢杆菌科都与健康和疾病相关组中的大多数因素密切相关，但对多样性进行调整时，所有乳球菌科的关联变得不显著，而几乎所有梭状芽孢杆菌科的关联仍然显著(图5和补充图7)。此外，拟杆菌属和苏特列拉属与宿主和生活方式因素表现出相似的显著关联模式，但调整香农多样性时，大多数拟杆菌属的关联变得不显著，而苏特列拉属的关联仍然显著(图5和补充图7)。这些结果表明，对于乳球菌科和拟杆菌属，与宿主因子的关联可能间接源于这些属和多样性之间的相关性，而梭状芽胞杆菌科和梭状芽胞杆菌科对于具有相似香农多样性值的个体显示出相同的关联模式。
图5 微生物属和多种因素之间的显著关联。图中显示的是微生物属的热图(x轴)，这些微生物属被发现与不同因素(y轴)显著相关，使用了经混杂因素调整的广义线性模型(见方法)。图中仅显示了具有至少20个显著关联的属，以及具有至少10个关联的因子。对于每种分析物(如生活方式、饮食、临床试验)，通过拟合广义线性模型来检验关联性(见方法)。重要的热图单元(在用FDR校正的p< 0.05校正多个假设后)由p值的重要性(由饱和度指示，例如，10或10的值指示p值= 110)和关联方向(由颜色指示，例如，红色正相关)表示。每一个因子都是由它所属的类别来着色的，每一个属都是由它所属的门来着色的。在调整微生物多样性后仍然显著的关联用星号标出。
我们还测试了四种菌之间是否存在不同组合簇，重复上述分析，增加宿主因子和微生物簇之间的相互作用项。我们在宿主因子和分类群之间发现了163个聚类特异性关联(补充数据5)。例如，在富含普雷沃氏菌的集群中，我们发现来自丹毒杆菌科的一个未分类属的丰度与自我报告的腹胀和恶心显著相关。然而，没有观察到其他微生物群与腹胀和恶心相关。此外，我们发现Akkermansia属和一个未分类的Christensenellaceae属的丰度与富含拟杆菌类的集群呈负相关(p< 0.05)。当检查推断的功能途径(方法)分析结果时，我们发现宿主因子基于它们与微生物途径的关联类似地聚集成健康相关组和疾病相关组(图6，补充数据6中的关联完整列表)。健康相关组包括通常与良好整体健康相关的宿主因素和行为，如更多的体力活动、更健康的饮食选择和更好的临床血液化学性质，而疾病相关组的因素通常与较差的整体健康相关，如BMI水平增加、消化症状以及与糖尿病、心血管疾病和炎症相关的风险标记物。值得注意的是，大多数多糖和碳水化合物代谢途径与疾病相关组呈正相关。此外，原发性和继发性胆汁酸代谢途径以及维生素或维生素样代谢途径与疾病相关组呈正相关。相反，异生物质代谢途径与健康相关组呈正相关。最后，调整模型，确定独立于微生物多样性的关联。我们发现，一旦考虑到多样性，某些微生物途径，如脂多糖生物合成，与疾病相关组无关，而其他途径，如原发性和继发性胆汁酸代谢，即使在调整多样性后，仍与疾病相关组相关，表明这些微生物途径与宿主因素和行为之间存在强有力的联系。
图6 微生物途径和多种因素之间的显著联系。图中显示了微生物途径(x轴)的热图，使用经混杂因素调整的广义线性模型，发现这些途径与不同因素(y轴)显著相关(见方法)。图中仅显示了至少有20个显著关联的代谢途径，以及至少有15个关联的因素(参见补充数据4中的关联完整列表)。
最近的研究揭示了药物对肠道微生物的影响。通过调整我们作为疾病生物标志物的临床测量模型，考虑药物及其相关疾病之间的关联(方法)。比较药物使用者和非使用者的属相对丰度和功能，并确定了药物使用和属的相对丰度之间的70个显著关联(补充数据7)。克雷伯氏菌属(肠杆菌科的一种机会性病原体)在服用血糖药物的个体中明显更多(倍数变化> 6，p值< 10-4)，这与二甲双胍(一种常见的血糖药物)对微生物的影响的研究一致。另一方面，在服用血糖药物的个体中，粪肠球菌属显著较低(经果糖二磷酸钠校正后P < 106)。此外，肠杆菌科和伯克霍尔德氏菌属的成员在使用降胆固醇药物的个体中大量增加，这与最近的一项研究一致，该研究包括分析他汀类药物对微生物的影响。检查微生物组的功能组成，我们分别确定了109和271种药物使用与预测的途径和模块丰度之间的显著关联(补充数据8-9)。宿主的生活方式和饮食会极大地影响肠道微生物群，进而影响宿主的新陈代谢和健康。对大约3400个人类肠道微生物群的研究使我们能够识别与健康和疾病相关的宿主-微生物群关联。我们还揭示了某些宿主表型关联在特定的微生物群落环境中是独特的，这表明微生物群落的异质性可能在饮食和生活方式干预的个性化表型反应中起作用。总的来说，我们的综合方法为肠道微生物群和宿主表型特征之间的复杂关系提供了见解，这对未来的临床和干预研究具有重要意义。肠道微生物组α多样性与人类健康有关，较低水平的多样性与几种急性和慢性疾病有关。了解微生物多样性的潜在分类驱动因素有助于我们了解微生物与健康之间的关系。以前对肠道群落组成和α多样性的分析主要使用线性方法或低多样性和高多样性集群之间的二元比较，通常表明拟杆菌门和多样性之间的负相关。然而，非洲农村个体和欧洲城市个体之间的肠道微生物群比较显示，在非洲农村发现了较高的类杆菌多样性和相应的富集。我们在拟杆菌和微生物群多样性之间发现了一种强烈的非线性联系，这表明这两种特征之间的关系是非单调的。因此，单一的衡量标准，如厚壁菌门-烟草门比率，可能无法全面说明组成、多样性和整体健康之间的关系。控制流行分类群的丰度可以揭示微生物组成和α多样性之间的一些微妙联系。埃格氏菌(一种假定的机会性病原体)和类杆菌调节的多样性之间的负相关强调了对优势类群的调节如何揭示重要的潜在关联，表明在给定的潜在组成情况下，偏离预期的多样性可能作为肠道健康的额外生物标志物。与以前的工作一致，我们发现肠道微生物组变化的主轴是厚壁菌门到拟杆菌门的轴，以及拟杆菌属和前拟杆菌属的不重叠分布。此外，我们发现两个假定有益的属，双歧杆菌属和粪肠球菌属，彼此呈负相关。先前的研究表明，这两个属都能对相似的饮食(如高纤维)或益生元产生反应。相反的关系表明，当这些属中的一个占优势时，另一个属可能会被竞争，可能与代谢生态位重叠有关。同样，厚壁菌门的两个科——松科和乳球菌科是呈反相关的，并驱动主成分空间的变化。确定宿主生活方式因素、宿主健康和肠道微生物群之间的联系可以设计干预措施和临床试验。然而，以前对这些关联的研究主要集中在总体微生物多样性上。我们对组成簇和簇特异性关联的分析揭示某些分类的富集如何影响宿主-微生物组的关系。这些集群特异性关联对定向饮食干预和微生物群改造有影响。近年来，许多研究表明，肠道微生物群中的特定特征与不同的健康标志相关，报告了肠道微生物群中的特定属与不同的生活方式或饮食因素之间的许多成对相关性。然而，是否能在整体肠道微生物组成中看到整体健康，而不仅仅是单个分类群，仍未解决。在这项研究中，我们不仅确定了超过1500个宿主因子与微生物属和途径之间的显著关联，还证明了这些宿主因子是根据它们在所有微生物属中的总体关联模式进行分组的。特别是，宿主因子聚集成“健康相关”和“疾病相关”组。事实上，许多宿主因素在个体之间并不直接相关，例如高密度脂蛋白胆固醇和步行或骑自行车的频率(p值= 0.82；斯皮曼相关)，当我们考虑它们的微生物关联模式时，仍然被归入健康相关组。类似地，在人群中的个体之间，糖化血红蛋白A1c (HbA1c)和腹泻频率(两者都是健康较差的指标)并不直接相关(P值= 0.74，斯皮尔曼相关)，而是根据微生物群的关联与疾病相关组的因素进行分组。因此，尽管某些个体健康因素、生活方式或饮食选择在人群中可能没有明显的相互关系，但与这些因素相关的肠道微生物群的潜在共同变化确实揭示了它们与健康的关系。因此，需要进一步研究微生物在健康中的参与或调节作用。由于许多饮食、生活方式和临床因素的相互关联性，很难发现独立的强大宿主-微生物群关联。然而，我们的大样本量加上我们广泛的表型，使我们能够解开混杂因素(如体重指数、饮食)并确定强有力的联系。通过调整年龄、性别、体重指数、饮食、种族和季节，我们能够确定微生物α多样性和剧烈体力活动之间存在显著独立联系。调整这些协变量(P < 104)后，Veillonella属也与剧烈的体力活动呈正相关，这与最近对优秀马拉松运动员的一项小型研究一致。因此，我们的结果提供了证据，表明剧烈体力活动的增加与肠道微生物群的结构和组成的一致变化独立相关。虽然我们对宿主因子的广泛表型和大样本量使我们有统计能力来识别许多宿主-微生物组的关联，但我们注意到这些关联并不意味着因果关系。理解方向和因果关系需要随机对照研究和干预，这可以控制已知和潜在的隐藏混杂因素。类似地，当我们调整许多共同变化的因素时，我们注意到统计调整不能完全解释所有的混杂因素，因为有许多因素仍未被测量。例如，某些与健康相关的活动是生活方式因素的表现，但生活方式的影响可能会在各种活动中累积，并非所有活动都将在特定人群中进行测量。在药物和疾病的情况下，虽然我们在检查药物使用和个体属之间的联系时考虑了年龄、性别、种族、季节和相关疾病生物标志物的水平，但这些调整可能无法完全区分药物对微生物群的影响和相关疾病状况的影响。需要使用体外或体内模型进行进一步的实验研究，以更好地理解特定药物对肠道微生物的直接影响，而与疾病状态无关。不管这些重要的警告，很明显微生物群与广泛的宿主表型密切相关，改造我们的共生微生物群的能力将可能是21世纪精确医学的重要组成部分。
