编译：gu作成熟，编辑：小菌菌、江舜尧。
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导读
亚马逊河是世界上最大的河流之一，从周围的雨林中吸收了大量的陆地有机质(TeOM)。尽管这种TeOM具有典型的抗降解性，但只有一小部分到达海洋，表明河流微生物组对TeOM的降解非常严重。然而，几乎不知道亚马逊河中涉及TeOM降解的微生物基因。
本文通过分析沿亚马逊河分布的30个采样点的106个宏基因组，研究了亚马逊河的微生物群。我们构建了亚马逊河流域微生物非冗余基因目录（AMnrGC），其中包括约370万个非冗余基因，主要与细菌相关。
结果发现，与其他相关的已知环境（河流和雨林土壤）相比，亚马逊河微生物群包含大量的独特基因。编码可能参与木质素降解途径的蛋白质的基因与三羧酸酯转运体和半纤维素降解机制相关，表明可能具有启动效应。
在此基础上，本文提出了一个模型，说明如何通过亚马逊河水域中的不稳定化合物调节顽固性TeOM的降解。结果还提示了河流沿线微生物群落及其基因组潜力的变化。本文工作有助于扩大我们对世界上最大的河流微生物群及其与TeOM降解相关的潜在代谢的理解。此外，产生的基因目录(AMnrGC)是未来热带河流研究的重要资源。
原名：Uncovering the genomic potential of the Amazon River microbiome to degrade rainforest organic matter.通讯作者：Flávio Henrique-Silva通讯作者单位：乌斯卡大学基因学和进化系分子生物学实验室作者分析了沿亚马逊河流域分布的30个采样点的106个宏基因组，每个宏基因组的平均有5.3×109（±7.4×109）个碱基对。从位于玛瑙斯市上游的索利蒙斯河和亚马逊河道中的湖泊开始，直到亚马逊河在大西洋中的羽流为止，取样点覆盖了约2106公里，分为5个部分（图1a）。这些河段分别是:
(1)上游河段(玛瑙斯市上游)，
(2)下游河段(位于玛瑙斯和亚马逊河口起始处之间)。
(3）河口段（河流与大西洋交汇的部分），
(4）羽流段（受亚马逊河输入影响的海洋区域），
(5）海洋（羽流周围盐度较高的区域）。之后对取样点进行宏基因组测序。
图1a 本研究中使用的106个元基因组在亚马逊河5个河段的分布情况:上游(紫色点)、下游(橙色点)、河口(红色点)、羽流(黄色点)和沿海海洋(白色点)。
亚马逊河基因是在共同组合了106个元基因组后预测出来的，这些元基因组具有相同的地理起源（图1a）。大约52%的AMnrGC基因在至少一个数据库中进行了注释，而约86%的注释基因在两个或两个以上的数据库中同时进行了注释。基因和功能的稀疏曲线趋于平稳，表明恢复的基因和功能多样性似乎是该微生物群的代表（图1c）。
图1c 非冗余基因和PFAM家族的Rarefaction曲线（内部图）。注意两个点都指向饱和。
我们将亚马逊河微生物组中包含的元基因组信息与亚马逊雨林土壤和其他现有温带河流中的元基因组信息进行了比较。对这些微生物群落的k-mer多样性比较表明，它们在基因组组成方面存在差异(图1d)，形成异质结构的群体（显著的β散布）。亚马逊河5个采样区(上游、下游、河口、羽流和海洋)的宏基因组组成(k-mer)存在显著差异(PERMANOVA，F= 2.34, p< 9.9 e−5;图2a)这表明河流剖面可能包含不同的基因组合。这些代表河段的组被认为是异质性的，因为每组中的元基因组样品之间存在显著的β分散（F=7.7，p=1e-3）（图2b）。此外，不同河段(上游、下游和河口)的淡水样品到中心点的距离比咸水和海洋样品短(图2b)。即使我们已经使用不同大小的分数来捕捉自由生活或颗粒附着的微生物，这并没有影响k-mer组成(PERMANOVA, F = 3.62, p= 0.06; β dispersion, F =3.62, p = 0.074; Fig. 2c)。
图1 d 根据信息含量[k-mer构成]将亚马逊河微生物组与其他微生物组进行比较的NMDS。亚马逊河(AMAZON)、亚马逊森林土壤(FOREST)、加拿大流域(CANADA)和密西西比河(MISSISSIPPI)。
图2 亚马逊河微生物组研究部分的元基因组和COG组成。根据从每个样品中k-mers的存在-缺失计算出的Jaccard距离(a-c)，组成不同河段的元基因组排序NMDS组差异有统计学意义[PERMANOVA, F =2.34, p = 9.99e−5]。(a)显示组内异质性[β dispersion; PERMUTEST, F = 7.72, p =0.001]。(b)按照微生物生活方式(自由生活(FL)与附微粒(PA))划分的亚马逊河微生物组元基因组组成。(c)NMDS组差异有统计学意义[PERMANOVA, F =3.62, p = 0.06]，显示组内均匀性[β dispersion];F =3.62, p = 0.074]。亚马逊河各大小河段的COG组成情况。(d)按河段和微生物生活方式(自由生活与附着颗粒)显示COG超类的基因功能。上游河段因未取样，故未在颗粒附着部分中显示。由于参考数据库中缺少直系同源物，约有48％的AMnrGC基因无法注释。此外，尽管AMnrGC中有大约1.6%的基因在之前的宏基因组研究中被发现，但它们的特征很差，没有被分配到一个特定的分类单元：(这里称为“宏基因组”基因;图1 b)。体而言，先前的结果强调了我们对亚马逊河微生物组基因组成的有限了解，在亚马逊河微生物组中，大多数蛋白质（61.1％）在主要参考数据库中没有直系同源物。原核基因(细菌基因占35.7%，古细菌基因占0.6%)在AMnrGC中占大多数，真核基因和病毒基因分别仅占0.3%和0.6%(图1 b)。
图1b 亚马逊河流域微生物非冗余基因目录(AMnrGC)。b AMnrGC中约370万个基因的分类。"未分配 "基因没有被指定分类，但它们在功能上被指定，这与 "未注释 "基因不同，后者没有任何同源基因。功能分析包括与COG、KEGG和/或PFAM数据库匹配的原核和真核基因。直系同源基因簇（COG）数据库中的超类“代谢过程”包括那些基因功能，这些功能涉及能量产生和转化，氨基酸，核苷酸，碳水化合物，辅酶，脂质和无机离子的运输和代谢，次级代谢产物的生物合成，运输和分解代谢。该代谢过程在AMnrGC中最丰富（占COG注释基因的35.8％；图2d）。从功能上讲，微生物的生活方式（即自由生活与颗粒附着）不会影响COG超类的分布（图2d）。来自AMnrGC的总共6516个基因被确定参与了来自Amazon River微生物群的潜在TeOM降解机制，分为纤维素降解（143个基因），半纤维素降解（92个基因），木质素氧化（73个基因），木质素衍生的芳香族化合物转运和代谢（2324个基因）和三羧酸盐转运（3884个基因）（图3、4和5）。与木质素衍生化合物代谢和三羧酸盐运输相关的大量基因变体（图4）反映了亚马逊河木质素氧化过程中产生的各种分子。在属于不同微生物生活方式的样品中(即自由生活与附着微生物)，基因的组成和分布没有显著差异。真核生物对分析功能的贡献很小(0.5-0.6%);因此，下文所分析的机制大多是原核的。
图3 亚马逊河微生物群中可能参与TeOM降解初始步骤的酶。木质素氧化(1)、纤维素(2)和半纤维素降解(3)：显示了每个家族的基因数量以及每个河段的分类群分布情况。TeOM由生物聚合物组成，因此其微生物降解的第一步就是将聚合物转化为单体。因此，我们研究了可能参与木质素氧化和纤维素和半纤维素降解的基因(图3)。我们观察到与纤维素降解有关的糖基水解酶GH3普遍存在。该功能代表了所有河段中与该分解代谢步骤有关的基因的63.2–65.3％（每节71±8个基因）（图3）。基因分类学分析（图3）表明，纤维素和半纤维素的水解主要是由已知的分类单元在淡水（70-81％）和微咸水（58-79％）中进行的。淡水中的Betaproteobacteria、Actinobacteria可能会降解纤维素，而Bacteroidetes, Alphaproteobacteria、 Gammaproteobacteria可能在海洋和羽状部分中占主导地位（图3）。有限部分的半纤维素降解似乎与Gamma- and Deltaproteobacteria有关，它们在河道中普遍分布。而Betaproteobacteria、Actinobacteri (在淡水中)和阿Alphaproteobacteria在半咸水中)似乎主要参与了不同河段中半纤维素降解的功能(图3)。在亚马逊河微生物组中发现了漆酶（每节19±2个基因）和过氧化物酶（每节42±6个基因），没有发现其他参与木质素氧化的家族，如酚酸脱羧酶或乙二醛氧化酶（图3）。木质素衍生的芳香族化合物在降解之前需要从细胞外环境运输到细胞质。在AMnrGC中发现了可能与木质素降解有关的转运蛋白（AAHS家族和ABC转运蛋白）（图4）。Alphaproteobacterial AAHS和ABC基因在羽流和海洋样品中的丰度增加（图4）。Betaproteobacteria的ABC转运蛋白富含淡水或微咸河段，而Alphaproteobacteria的ABC转运蛋白富含盐分较高的河段（图4）。与可能参与TeOM降解的主要类群不同，Actinobacteria对木质素衍生化合物运输的功能贡献较小，在河道中分布更为均匀(图4)。马逊河中木质素衍生化合物的可能降解途径（图4和5）包括772和449个基因，分别可能属于二芳基和单芳基的漏斗路径（图4）。对从vanilate和syringate开始的通路的检查显示，有1059个基因可能负责环切通路。AMnrGC中与木质素衍生化合物降解相关的所有基因中，约有47%属于4个基因家族(ligH、desV、phcD或phcC)。这些基因代表细胞内木质素代谢的主要步骤，它们是（1）导致香草酸/丁香酸酯化的漏斗途径（图4），（2.1）O-去甲基化/ C1代谢和（2.2）环裂解（图5）。上述木质素氧化和木质素衍生化合物转运的分类模式也在可能与漏斗通路相关的基因中被观察到(图4)，包括后步(图5)。在靠近海洋的河段中，富含Alphaproteobacteria，而在这些段中，Actinobacteria基因的数量减少了（图4和5）。们还观察到，随着盐度的增加，Betaproteobacteria的相对功能贡献降低，Gammaproteobacteria的功能富集（图4和5）。
图4 亚马逊河中木质素衍生化合物的转运蛋白和二聚体和单体的漏斗路径。显示了每个蛋白质家族的基因数量和分类法。
图5 主要蛋白质家族可能参与木质素衍生化合物代谢的最后步骤。化合物的O-去甲基化和C1代谢显示在蛋白质家族和分类中(左)，以及指示底物进入丙酮酸的环裂解步骤，丙酮酸进入TCA循环转化为ATP和CO2(右)。我们的结果表明，有限数量的广泛分布的属或基因组以其功能机制促成了亚马逊地区的TeOM退化，特别是来自海洋和羽流的盐样(表1)。除纤维素水解外，主要有两个低等分类单元HIMB11（红杆菌科）和Pelagibacter对海洋和羽流样品中的所有TeOM降解步骤均起作用。反过来，导致亚马逊河河段TeOM降解的低等分类群基因比海洋和羽流样本中存在的基因更加多样化，表明存在微生物群落（表1）。体而言，在亚马逊河、羽流和海洋区域，进行TeOM降解的主要基因组或属之间存在明显的盐度划分。
我们评估了可能与TeOM降解相关的基因是否在河道上显示出空间分布模式（图6）。为此，我们使用了采样点到秘鲁亚马逊河水源的线性地理距离。木质素氧化、环裂解途径、三羧酸盐运输、AAHS转运蛋白相关的基因数量与河源的线性距离呈负相关（图6）。当河流进入海洋时，与木质素处理有关的微生物基因库可能减少，这表明河流在流经亚马逊河期间，木质素会老化。AAHS转运蛋白与到亚马逊河源的距离呈负相关，而ABC转运蛋白与该距离没有相关性（p> 0.01）（图6）。TTT系统中的基因数量与到亚马逊河水源的距离呈负相关，表明它们在河流的淡水区域中占主导地位（图6）。TTT转运蛋白与木质素氧化基因呈正相关，表明它们可以转运木质素衍生产物或TTT与机械氧化木质素的偶联。TTT系统与AAHS和ABC转运蛋白正相关（图6），指出可能的功能互补性，因为TTT会转运其他转运蛋白家族未转运的底物。木质素衍生芳香族化合物加工相关的基因机制与河道中与木质素氧化相关的机制正相关(图6)，表明木质素及其副产物的协同加工。就基因而言，纤维素降解与木质素氧化不相关（p> 0.01），但与半纤维素降解具有适度的正相关关系（图6），表明这两种途径之间存在耦合。我们发现与二聚体的漏斗途径和环裂解途径相关的两个基因之间的相关性，以及与亚马逊河源的距离（图6）。这表明，木质素衍生芳香族化合物的降解可能遵循与木质素氧化机制类似的模式，主要限于河的上游部分。此外，可能与半纤维素/纤维素降解相关的基因数量与可能与木质素衍生单体和二聚体漏斗化途径相关的基因数量正相关。这可能反映了木质素衍生化合物和半纤维素降解的潜在协同代谢，而不是木质素氧化。
图6 TeOM处理相关基因的相关性及其与环境变量的相关性。与木质素氧化、纤维素和半纤维素解构、运输系统(AAHS、ABC和TTT)、木质素衍生芳香族化合物加工途径(环裂解途径)相关基因数量的相关性以及环境变量(溶解的无机碳- DIC、溶解的氧- DO、温度、电导率、采样深度——采样点到亚马逊河源头的深度和线性距离)。相关系数显示在框内，其颜色表示相关强度。白方框无显著性相关(p >0.01)
与TeOM降解相关的潜在过程似乎也与特定的环境变量相关（图6）。木质素衍生分子的转运体与测量的环境变量之间存在边际相关性(图6)。具体而言，ABC转运蛋白与任何变量均无相关性。然而，AAHS转运蛋白与温度和电导率呈负相关。TTT转运体在温度、DIC、DO似乎与木质素氧化的趋势相似。质素衍生分子的初始代谢步骤似乎与环境异质性无关(图6)，除了与温度相关的二聚体漏斗路径相关的功能外。木质素衍生分子加工的最后几个步骤，即环裂解，与环境异质性密切相关。
基于我们的发现，我们为亚马逊河中木质纤维素复合物的潜在启动效应假设了一个模型(图7)。在这个模型中，有两个不同的群落共存于一个群体中:一个可能负责半纤维素/纤维素的降解，另一个可能参与木质素的降解。第一个群落会释放细胞外酶(主要是GH3和GH10家族的糖基水解酶)，产生不同种类的碳水化合物。这些碳水化合物可以为整个联合体提供结构碳和能源。潜在的木质素降解群落也会利用纤维素降解的副产物来生长，从而促进氧化代谢。这种氧化代谢可以触发活性氧(ROS)的产生和分泌(图7)。然后，ROS被这些假设的木质素分解群落分泌的DyPs和漆酶用来氧化木质素，暴露更多的半纤维素/纤维素给纤维素分解群落，重新启动这个循环(图7)。另一个重要的作用是降解木质素氧化过程产生的木质素衍生芳香族化合物。这些化合物如果不能降解，就会抑制纤维素分解酶和微生物的生长，防止TeOM退化。这一循环可以被认为是一种启动效应，两族相互受益。
图7 亚马逊河微生物群落降解的启动效应模型。纤维素分解群落通过分泌糖基水解酶(主要是GH3/GH10)来降解半纤维素，并将糖释放到环境中。这些糖可以促进纤维素分解群落和木质素分解群落的生长，在这个过程中，氧化代谢产生活性氧(ROS)。ROS激活木质素降解群落分泌的胞外酶(主要是DYPs和漆酶)来氧化木质素。木质素氧化后，半纤维素再次暴露出来，帮助纤维素分解群落将其降解。在前一个过程中，形成了几个芳香化合物，可能抑制纤维素分解酶和微生物的生长。然而，这些化合物被木质素分解微生物消耗，降低了它们在环境中的浓度，使分解得以进行亚马逊河是连接陆地、大气和海洋生态系统的主要碳链。我们的工作代首次将TeOM输入亚马逊河与可能导致其降解的微生物代谢联系起来。我们确定了基因和代谢可能是TeOM降解的关键。此外，我们的结果表明，在某些情况下，TeOM相关基因的差异分布似乎是由环境异质性驱动的。我们的工作还生成了AMnrGC，这是询问Amazon River微生物组功能以及进行生物勘探的重要资源。鉴于亚马逊河流域许多地区的范围和难度，我们的工作是重要的第一步，可以为未来雄心勃勃的采样活动铺平道路，这些活动将调查基因表达、宏蛋白组学和亚马逊河微生物群在现场或实验室实验中降解TeOM的能力。
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