染色质免疫共沉淀（ChIP检测）实验流程

染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation），是检测转录因子等蛋白与DNA之间相互作用的主要实验方法之一。在活细胞内使用甲醛将DNA和蛋白交联，使用超声将染色质切成很小的片断，并沉淀下来。通过目的蛋白的抗体将蛋白免疫共沉淀，富集。通过定量PCR检测使用特异性引物对蛋白可能结合的DNA进行扩增检测。实验流程：1、细胞交联与超声破碎1 将细胞培养在15cm培养皿中，待细胞长到70%融合度时，根据实验目的进行细胞处理。培养到指定时间点后，去除培养基，加入预冷的PBS洗一次后将细胞消化下来后转移至15ml离心管中，1000rpm离心去除上清，加入5ml PBS缓冲液，加入甲醛至终浓度为1%，室温置于摇床上轻轻晃动20min。加入2.5M Glycine至终浓度0.125M终止交联。在4℃下轻轻晃动10min。在100g，4℃离心5min。弃上清，加入10ml 预冷的PBS洗两次，离心去除上清。2 加入2 ml cell Lysis Buffer（含2.5 μl 蛋白酶抑制剂）重悬细胞。冰上孵育15min，每隔5min振荡一下细胞悬液。孵育之后，用Dounce匀浆器将细胞悬液匀浆化10次以促进核释放。3 4℃ 800 g离心5 min。去除上清，用0.5 ml Nuclear Lysis Buffer（含2.5μl蛋白酶抑制剂）重悬细胞。4 超声破碎：使用超声仪在中档，冲击13s，冰上放置45s，共6次。取5μl细胞裂解液进行电泳检测未打断的DNA。5 4℃ 12000rpm离心10 min除去不溶解的沉淀。将上清液转移至心的EP管中，分为50μl一份。2、免疫共沉淀1每个IP实验需要450μl Dilution Buffer和2.25μl蛋白酶抑制剂。测试样品包括：阳性对照Anti-Histone H3，阴性对照Normal Rabbit IgG，目的抗体。2 超声好的50μl样本置于冰上，加入450μl稀释液（含2.25μl蛋白酶抑制剂），轻轻混匀后，去除5μl冻存，作为input。3 分别加入不同抗体和20μl混匀的protein A magnetic beads。阳性对照抗体，4.0 μg抗体每管。阴性对照IgG，5.0 μg抗体每管。目的抗体，每管加5.0 μg抗体。4 4℃旋转孵育过夜。5 使用磁力架将Protein A magnetic beads沉淀下来，轻轻去除上清。6 加入0.5ml预冷的缓冲液，在旋转台上孵育5min后置于磁力架上，去除上清。7 低盐清洗缓冲液、高盐清洗缓冲液、LiCl清洗缓冲液、TE缓冲液分别洗1次，每次5min。将样本置于磁力架上，去除上清。8 洗脱Protein/DNA复合物和反交联Protein/DNA复合物为单独的DNA。9 加入100μl ChIP清洗缓冲液，62℃振荡孵育2 h10 95℃孵育10 min。然后将样品置于室温冷却。11 将样本置于磁力架上，将上清液移到一个新的管子中。3、DNA纯化1 将0.5 ml Bind Reagent A加入每个100 μl的DNA样品管中并混匀。将样本转移至离心柱上管中，12000rpm离心1min。去除下管液体。2 加入0.5 ml Wash Reagent至离心柱上管中，12000rpm离心1min。去除下管液体。3 12000rpm离心2min。丢弃下管。将上管置于新的管中，在离心柱上加入50μl Elution buffer，常温放置2min，12000rpm离心1min。4 去除离心柱，下管加入20μl洗脱液就是纯化的DNA，直接用于定了PCR检测或存于-20℃。4、定量PCR检测1 使用紫外分光光度计检测纯化DNA含量2 PCR体系：试剂体积DNA2µLPCR上游引物（10µM）0.4 µLPCR下游引物（10µM）0.4 µLSYBR Green solution10 µL灭菌双蒸水7.2 µL总量20 µL3 定量PCR检测反应条件：95.0 ℃10min95.0 ℃15 s40 cycles60.0 ℃1min95.0 ℃15 smelt curve60.0 ℃1 min95.0 ℃15 s实验结果示例：

图 ChIP检测结果示例图A ChIP检测DNA跑胶示例图。B ChIP检测结果分析示例图。C ChIP检测扩增曲线示例图。D ChIP检测溶解曲线示例图。