编译：艾奥里亚，编辑：十九、江舜尧。
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导读
酗酒和长期接触酒精会导致酒精性肝病的发生(ALDS)。目前已有研究发现，ALDS和昼夜节律的紊乱之间存在潜在的联系，但不同酒精摄入模式如何对肝脏昼夜节律代谢产生不同的影响实际上仍未被探索。基于急性和慢性乙醇饲养，研究者揭示了肝脏中昼夜节律相关转录组的差异性重编程。具体地说，日常SREBP转录途径的重新连接导致乙酰辅酶A代谢中不同的肝脏信号，这些信号被翻译成蛋白质乙酰化的亚细胞模式。因此，不同的饮酒模式决定了肝脏昼夜节律代谢的不同代谢适应。原名：Distinct metabolic adaptation of liver circadian pathways to acute and chronic patterns of alcohol intake译名：肝脏的昼夜节律途径对急性和慢性酒精摄入的不同代谢适应期刊：Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America（PNAS）通讯作者单位：美国加利福尼亚大学（University of California）DOI号：10.1073/pnas.1911189116为了探索长期摄入酒精如何改变日常的新陈代谢和行为，9周龄的雄性C57BL/6小鼠被随机分配到对照组或饮酒组。第1周使用与对照组相同的饲料饲养，随后维持1周的过渡期，在此期间乙醇浓度递增。随后，小鼠接受含乙醇(慢性乙醇，EtOH)或含等热量碳水化合物(慢性对照，Ctrl)的Lieber-DeCarli饲养4周。在开始乙醇喂养一周后，接受慢性乙醇饮食的小鼠的体重略低于慢性对照组饮食的小鼠(图1A)。代谢笼分析表明，尽管两组小鼠食物摄入量和能量消耗相似，但慢性乙醇饮食的小鼠表现出更高的氧耗量(VO2)和呼吸交换率(RER)，这表明底物氧化从碳水化合物到脂质的代谢转移（图1B-G）。耐人寻味的是，慢性乙醇饮食的小鼠的运动活动受到干扰并表现出下降的趋势（图1H-K）。具体来说，但采用乙醇喂养后，该组小鼠白天运动节律性明显减弱，同时该组小鼠的夜间活动显著减少(2.5倍)，白天活动略有增加(图1 H-K)，这与先前的研究一致。这些结果表明，长期使用酒精改变了生物体水平的昼夜新陈代谢和行为。图1 酒精诱导的代谢和行为的生理紊乱。A代表慢性乙醇喂养小鼠(n=22)和对照组小鼠(n=14)在实验过程中体重变化；B代表48小时内食物摄入量的代谢笼分析(n=6)；C代表个体小鼠在白天和夜间的累积摄食量；D代表48小时内氧气消耗的代谢笼分析(n=6)；E代表白天和夜间的VO2平均值；f代表48小时内RER（=VCO2/VO2）的代谢笼分析(n=6)；G代表白天和夜间的RER的平均值；H代表慢性对照组和慢性乙醇组喂饲小鼠的典型行为图；I-J代表慢性对照组(n=8)和慢性乙醇组(n=16)小鼠在第38天至第40天的时间序列和定量运动活动的平均值；K代表慢性乙醇组小鼠活动计数的时间序列。2 急性和慢性乙醇摄入对肝脏昼夜节律转录的特异性标志随后，研究人员探究了酒精是否会对肝脏中的生理基因表达谱造成影响。近期的研究表明，慢性乙醇摄入可能会影响肝脏的生理节律。为了探究急性与慢性酒精摄入如何影响全基因组水平上的生理基因表达，在时间为0的时候，以口灌胃的方式给雄性小鼠口服酒精(急性乙醇)或等热量葡萄糖(急性ctrl)。随后分别在1、4、8、12、16和20的昼夜周期中采集肝脏样本（图2A-B）。基于RNA序列(RAN-seq)表明，乙醇诱导了许多基因的波动（图2C-D）。在急性无水乙醇处理中，这些新循环基因的时相聚集在ZT4到ZT10附近，而在对应空白组中的小鼠，其基因节律性的表达反映出这些小鼠对酒精的强烈反应（图2E）。尽管两组节律基因的波动均由酒精重新分布，但其总体差异在平均值上是可忽略的（图2E-F）。值得注意的是，在急性EtOH组的小鼠中，常见的环状转录物的幅度较高，进一步支持酒精对基因表达的肝脏反应的稳定作用。为了探究酒精对基因表达的长期影响，分别在0、4、8、12、16和20天等6个时间点收集了慢性EtOH饮食小鼠的肝脏样本(图1和图2H、I)。与急性EtOH形成鲜明对比的是，慢性Ctrl肝中的大多数节律基因在慢性乙醇肝脏中停止振荡，而少数基因在慢性乙醇作用下振荡，以支持慢性酒精处理引起的代谢和行为的昼夜节律紊乱(图1和2J和K)。虽然慢性Ctrl或慢性乙醇特异的节律基因的相位分布相似，但慢性乙醇似乎在两组振荡的基因中诱导相位预期(图2L和M)。此外，在慢性乙醇作用下，常见振荡基因的振幅较低，强调了长期摄入乙醇会影响肝脏的昼夜节律。总而言之，这些结果表明，肝脏对乙醇的每日基因组反应因酒精“给药方式”的不同而有很大不同。图2 急性和慢性乙醇喂养对肝脏生理节律的不同改编。A代表急性乙醇喂养实验设计方案；B代表急性乙醇喂养的膳食组成；C以Venn图形式展示了A-CTRL和A-EtOH处理小鼠中的肝细胞节律性基因数目；D图以热图形式展示了在急性Ctrl组（左），急性EtOH组（中间）和两个急性组（右）的循环基因；E以直方图的形式展示了节律基因的峰值在急性Ctrl或急性EtOH(左)和急性条件下(右)的波动；F代表急性EtOH组与急性Ctrl组相比在峰值的延迟；G代表两组节律基因振荡振幅分布；H代表慢性乙醇喂养实验设计；i代表长期控制和乙醇喂养的饮食组成；J以Venn图的形式展示了慢性Ctrl和慢性EtOH小鼠振荡基因的数量；K以热图形式展示了在慢性Ctrl组（左），慢性EtOH组（中间）和两个慢性组（右）的循环基因；L以直方图的形式展示了节律基因的峰值在慢性Ctrl或慢性EtOH(左)和急性条件下(右)的波动；M代表慢性EtOH组与慢性Ctrl组相比在峰值的延迟；N代表慢性处理两组节律基因振荡振幅分布。基因分析揭示了由酒精驱动的节律基因丰富的不同生物学过程（图3A-B）。具体来说，在急性Ctrl中DNA损伤响应较强，而蛋白质定位和转运在急性EtOH中表达过高（图3A）。有趣的是，与慢性Ctrl和EtOH小鼠相比时，也发现了类似的途径，但结果相反；蛋白质定位和转运在慢性Ctrl中富集，而DNA损伤反应在慢性EtOH中表达过高（图3B）。即使在急性和慢性两组之间也可以看到不同的富集途径模式，这可能是在急性Ctrl组ZT 0时饮食组成的差异以及葡萄糖的使用所致。事实上，单一的液体饮食会影响不同于chow饮食的昼夜节律基因表达。在急慢性Ctrl日间基因节律的重叠说观察到的结果同样验证了这一事实（图3C）。另一方面，Ctrl和EtOH中的波动的基因在急慢性条件下都具有昼夜节律，说明了核心基因表达的弹性特性。具体来说，NAD+和乙酰-CoA代谢引起了在生物钟系统中的调节，这种调节是通过BMAL1的乙酰化以及时钟控制基因启动子的组蛋白等来完成的。由于酒精改变了肝脏中NAD+和乙酰-CoA的水平，本研究探讨了酒精治疗是否会影响肝脏的生物钟机制。急性EtOH对核心生物钟基因和蛋白质的影响最小，只引起轻微的波动（图2F）。另一方面，慢性EtOH引起生物钟基因和蛋白质表达的阶段性进展（图2M）。可以预见，BMAL1乙酰化的急性反应对生物钟转录的影响很小，而反复的BMAL1乙酰化变化可能触发一种直接影响生物钟转录的适应性反应。本研究结果支持酒精部分通过BMAL1乙酰化调节时钟功能的设想。图3 急性和慢性酒精喂养对不同生理节律的影响。A代表在节律基因中富集的前5种生物过程在A-Ctrl和A-EtOH中振荡及其基因的数目；B代表富含有节律基因的5种生物过程在C-Ctrl和C-EtOH基团中振荡及其基因的数量；C以Venn图展现了急性和慢性Ctrl组（上部）、急性和慢性EtOH组（中间）和急慢性治疗组（底部）的振荡基因数目；D代表在A-Ctrl，A-EtOH，C-Ctrl以及C-EtOH组有节律性基因丰富的脂质代谢过程。3 SREBP依赖性转录对急性和慢性乙醇摄入的差异性响应为了解释乙醇摄入所引起的转录途径的变化，基于MotifMap对昼夜节律转录本进行了转录因子结合位点(Tfbs)分析，并对每种条件下的相关节律转录因子(Tfs)进行进一步的Meta分析（图4A-B）。有趣的是，SREBP1及其结合基序在急、慢性ctrl条件下高度富集。SREBPs是调节脂质稳态和代谢的碱性基本-螺旋-环-螺旋亮氨酸的拉链因子。当SREBPs具有重叠功能时，SREBP1优先激活与脂肪酸合成有关的基因，而SREBP2则激活胆固醇生物合成所需的基因。将本研究转录组中基因表达谱与目前已知的肝脏SRESREP1靶基因进行比较，可以发现，急性EtOH诱导了SRESREP1靶基因的表达，但被慢性EtOH所抑制（图4C-D）。通过基因集富集分析同样验证了这一点，这表明SREBP1靶基因在ZT4小鼠急性EtOH摄取下显示较高的表达，而相同的基因组在ZT16慢性CTRL小鼠中显著富集（图4E-F）。此外，急性Etoh小鼠的SREBP 1靶基因数目略高于慢性Etoh小鼠，而慢性Etoh小鼠的SREBP 1靶基因数目则显著降低，表明慢性Etoh摄入使SREBP 1的节律激活受到严重抑制（图4G-H）。包括Acly、Acaca和Farn在内的典型的SREBP1靶基在急性EtOH、慢性EtOH小鼠中的表达谱同样可以证明这一结果（图4I-J）。事实上，慢性EtOH显著降低了肝脏SREBP1的基因表达和核蛋白水平，在急性EtOH中也获得了类似的结果，这一结果表明其他转录因子(如ChREBP)在急性EtOH诱导的基因合成中可能起了作用（图4I-J）。在慢性EtOH组中，与胆固醇生物合成有关的SREBP2靶基因例如Hmgcr、Hmgcs1和Dhcr24有稍许的增加，但在急性Ctrl和急性EtOH之间表达量相似（图4I-J）。值得注意的是，在慢性EtOH喂养中观察到的SREBP1抑制和SREBP2活化在肺肿瘤的肝脏中进行了概括，表明了常见的基础病理生理学。这些结果表明，慢性乙醇摄入部分会通过促炎途径调节肝脏脂质合成。尤其令人感兴趣的是，脂质代谢与炎症之间的双向相互作用与肝病的发病机制密切相关。总之，在急慢性处理中，酒精似乎以相反的方式影响肝脏的昼夜节律。乙酰辅酶A（Acetyl-CoA）是代谢的主要中间体，其细胞水平反映细胞的代谢状态。重要的是，乙酰辅酶A作为赖氨酸乙酰转移酶（KATS）的底物，其浓度的波动与动态蛋白乙酰化直接相关。转录分析表明，乙醇重排了昼夜节律SREBP的转录（图4C-D），一种新的脂类生物合成途径：利用乙酰辅酶A作为构建块。事实上，乙醇改变了几个编码乙酰辅酶(如Acly)和使用(例如Acaca)的限速酶的SREBP的转录（图4I-J）。由于乙酰-CoA的生成可能通过乙醇氧化乙酸乙酰辅酶途径(ACSS)而增强，因此，研究者探究了急性和慢性乙醇如何影响整体的蛋白乙酰化。为了解决这一问题，对在急性和慢性乙醇摄入后在ZT4时间点采集的肝脏样品进行了乙酰化结合蛋白质组分析。这也是因为急性或慢性EtOH摄入对ZT4的BMAL1乙酰化有不同的调节作用（图5A-B）。基于免疫沉淀反应从蛋白质组的总肽中分离出乙酰化的肽，用于鉴定缩醛化的蛋白质。在肝脏中检测到的2170个蛋白质中，急性EtOH中的11个蛋白质和慢性EtOH中的576蛋白质与其各自的对照组表现出差异性表达（图5B）。730个蛋白质被乙酰化，具有2110个独特的乙酰化位点（图5A）。值得注意的是，58个蛋白质乙酰化表现出差异，与慢性Ctrl相比，在慢性EtOH中有69个独特的乙酰化位点，而在急性Ctrl和EtOH肝脏中没有发现有显著乙酰化变化的蛋白质（图5A）。在慢性乙醇喂养差异乙酰化的蛋白质中，38个蛋白亚乙酰化具有45个独特的乙酰化位点，此外有20个蛋白质高度乙酰化具有24个独特的乙酰化位点（图5A）。差异缩醛化蛋白质的GO分析表明，低缩醛化蛋白质属于葡萄糖和糖原代谢，例如磷酸甘油酸激酶1(PGK1)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、糖原磷酸化酶(PYGL)和果糖二磷酸酶1(FBP1)。其他的低乙酰化蛋白质包括蛋氨酸和半胱氨酸代谢相关的酶（图5C）。相反，超乙酰化蛋白质被富集用于脂肪酸氧化，其中包括羟酰基-Coa脱氢酶α(HADHA)、中链酰基-CoA脱氢酶（ACADM）和烯醇化辅酶-δ异构酶1(ECI1)（图5C）。这些结果提示慢性暴露于乙醇导致独特代谢途径中的酶的差异缩醛化。不同的代谢途径发生在不同的亚细胞室中。同样，节律蛋白乙酰化也因亚细胞室的不同而不同，并与各自细胞中乙酰-CoA的合成密切相关。通过GO分析表明，在葡萄糖/糖原代谢和脂肪酸氧化中分别富集了低缩醛化的蛋白质和高缩醛化的蛋白质，作者假设蛋白质的定位可能决定在慢性乙醇饮食的情况下的独特的缩醛化模式。为了验证这一猜想，使用蛋白质定位数据库注释了乙酰化蛋白的细胞定位。有趣的是，胞浆蛋白易于进行低缩醛化，而线粒体蛋白质似乎被慢性EtOH过度缩醛化；胞浆和线粒体蛋白质均不通过急性EtOH而被差异地缩醛化（图5D）。与这一观察相一致的是，肝的亚细胞分馏显示线粒体蛋白确实被慢性EtOH过度乙酰化，可能反映出整个肝提取物中蛋白质乙酰化程度的整体增加（图5E）。接下来，重点研究了胞浆和线粒体产生乙酰-CoA的代谢途径。作者从蛋白质组数据集中提取了参与乙酰-CoA代谢的蛋白质发现，在慢性EtOH暴露后增加了属于线粒体乙酰-CoA途径的蛋白质，特别是由乙醇衍生的乙酸酯产生的ACSS3的酶的表达，并与该细胞中的蛋白质缩醛化的增加平行（图5F）。相反地，在细胞质内的乙酰-CoA途径中，大部分的SREBP靶标被慢性EtOH饲养所抑制，这与胞质溶胶中蛋白质乙酰化水平的降低有关（图5F）。例如，在慢性EtOH喂养后，胞液中将柠檬酸转变为乙酰辅酶A的ACLY有所减少（图5F）。此外，ACSS2也通过长期暴露于EtOH而降低，该ACSS2负责产生乙酸衍生的乙酰-CoA的胞浆池。值得注意的是，在急性EtOH喂养中未观察到在乙酰-CoA途径中蛋白质水平的变化。这些结果表明，慢性酒精处理改变了通过生理SREBP1途径在胞质溶胶和线粒体中产生的肝醋酸-CoA的产生，这很可能被转化为在每个亚细胞隔室中的不同的蛋白质乙酰化模式。图5 代谢酶的乙酰化以及乙酰-CoA代谢的划分。a以热图形式显示急性或慢性乙醇（Etoh）喂养在ZT4（n=4）的差异乙酰化肝蛋白；b以热图形式显示急性或慢性乙醇喂养在ZT4(n=4)差异表达的蛋白质；c以Gene ontology分析结果表明在慢性乙醇喂养的小鼠中富含低和高乙酰化蛋白质的前5个生物过程及其数量；d以火山图形式表明急慢性Etoh小鼠胞浆蛋白和线粒体蛋白的差异乙酰化；e代表急性(左)、慢性(右)乙醇喂养肝全蛋白裂解物的代表性免疫印迹结果；f代表描述亚细胞乙酰辅酶A代谢途径和相应的肝蛋白水平。总之，各种酒精消耗对肝脏昼夜基因表达有差异地重新编程，并触发亚细胞蛋白乙酰化的不同。急性和慢性乙醇喂养对SREBP通路日调节的相反影响表明，慢性乙醇摄入具有转录适应作用，而急性暴露则更多地反映了应激反应。而急性乙醇肝脏中，没有发现蛋白质乙酰化的显著变化恰好证明过了这一点。总之，这些发现有助于进一步了解酒精性肝损伤的差异潜在机制，并有助于确定昼夜节律的治疗目标和策略。
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