科研 | Small：转录组测序揭示了人类肺细胞对氧化石墨烯的急性和长期暴露的差异反应
编译：冬日暖阳，编辑：十九、江舜尧。
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大量研究显示基于石墨烯的材料（包括氧化石墨烯（GO））的生物影响，但对其长期影响的研究较少。近年来，基于机理的纳米材料危害评估已经取得了重大进展，本文利用RNA测序挖掘人类肺细胞对GO的反应。对源自正常人支气管上皮的BEAS-2B细胞系进行重复的低剂量GO暴露持续28天，或暴露于等量的GO累积量48小时，利用RNA测序对样品进行分析，并对差异表达的基因进行途径分析和GO富集分析。结果表明低剂量的长期暴露与大剂量的短期暴露之间存在显着差异，接触GO 48小时会导致线粒体功能障碍。GO暴露28天导致凋亡途径，参与了凋亡蛋白（IAP）家族抑制剂基因下调。进一步证明长期接触GO会影响肺细胞的凋亡阈值，并伴有IAP抑制。本研究表明利用RNA测序检测纳米安全性研究的重要作用，同时表明急性接触GO与长期作用存在区别。
论文ID
原名: Next-generation sequencing reveals differential responses to acute versus long-term exposures to graphene oxide in human lung cells
译名: 转录组测序揭示了人类肺细胞对氧化石墨烯的急性和长期暴露的差异反应
期刊: Small
IF: 10.856（1区）
发表时间: 2020.3.29
通讯作者: Bengt Fadeel
通讯作者单位: 瑞典卡罗林斯卡学院
DOI号: 10.1002/smll.201907686
实验设计
采用改良的Hummers方法生产不同横向尺寸的GO样品，分组处理人肺细胞BEAS-2B细胞。慢性、低剂量组：每周2次将BEAS-2B细胞暴露于1或5μgmL-1的环境中，长达4周（换言之，总剂量分别为8和40μgmL×1）。急性、高剂量组：将细胞暴露于相同的累积剂量（8、40和80μgmL-1）48小时。分别在48小时、1周和4周将细胞使用Illumina NovaSeq 6000测序平台进行RNA测序，经过初步的统计处理后，使用智能路径分析（IPA）工具和用于注释、可视化和综合发现的数据库（DAVID）进行了进一步的生物信息学分析。用阿尔玛蓝测定法进行细胞活力；基于发光的Cell Viability Kit 试剂盒检测ATP水平；使用TMREM线粒体测定线粒体膜电位；利用流式细胞仪检测细胞周期/凋亡；使用Sircol分析试剂盒评估胶原蛋白的分泌和沉积。利用Western Blot检测蛋白相对蛋白含量的差异，以GAPDH作为内参。
研究内容
1人支气管上皮细胞暴露于氧化石墨烯（GO）
本研究中的GO样品采用改良的Hummers方法生产，由单层至几层的薄板组成，这些薄板的表面化学性质和厚度相似，但横向尺寸却有所不同。大GO（GO-L）横向尺寸在1至30m之间，小GO（GO-S）横向尺寸在50至2m之间；超小型GO（GO-US）横向尺寸为50-300 nm。
本文选择利用等效剂量的GO对人肺细胞BEAS-2B细胞系进行了急性和长期暴露（请参见图1a中的示意图）。分别在48小时、1周和4周后对细胞进行转录组学分析。
2基于转录组学的GO急性暴露评估
BEAS-2B细胞暴露于三种不同的GO材料（GO-US，GO-S和GO-L）48小时，未观察到细胞毒性（图1b），对转录组数据进行进一步分析。
图1.长期和短期接触不同侧面尺寸的GO。A）实验设计。B）暴露48小时后，用阿尔玛蓝测定法进行细胞活力。 DMSO作为阳性对照，未观察到显着差异。C）暴露28天后的细胞活力评估。在28天时，收集附着的细胞，并在新鲜细胞培养基中再培养24小时，然后评估细胞活力。
2.1 差异基因表达分析
RNA测序显示大量的差异表达基因（DEG），相对于第28天，在48小时上调（图2a）和下调（图2b）DEG的venn图表明，DEG之间几乎没有重叠。
图2.通过暴露于GO-US、GO-S和GO-L 2天（48小时）和28天的BEAS-2B细胞的差异表达基因的venn图。A）在长期重复28天低剂量反复暴露于GO-US、GO-S和GO-L时上调的基因的比较。B）以与（A）中相同的剂量暴露于GO-US、GO-S和GO-L的下调基因的比较。
2.2 典型途径富集分析
对比48小时相对于28天在相应的GO-L累积浓度下获得的样品的途径分析结果（图3）。结果表明，短期和长期接触GO-L的途径水平存在明显差异，这与在DEGs水平分析一致，如图2所示。
图3. RNA测序数据的下游分析揭示了GO急性暴露与慢性暴露之间的差异。通过IPA识别的顶级经典途径的层次聚类分析。热图中的颜色编码描述了路径的激活z得分。
3 GO对线粒体功能障碍的急性影响的验证
利用IPA软件工具检查有关毒性途径的RNA测序数据，确定了GO暴露后受影响最大的毒性终点，用于推断毒性机理。图4a为在40μgmL-1GO-US、GO-S和GO-L暴露48小时的BEAS-2B细胞的分析结果。所有3种GO材料中受影响最严重的途径是“线粒体功能障碍”。为了验证，基于TMRE标记确定了细胞内ATP水平（图4b）以及线粒体膜电位（图4c）。结果表明，与RNA测序数据一致，细胞ATP含量降低（GO-L显着变化），线粒体膜电位的损耗也随之增加（3种GO材料均显着变化）。为了进一步研究GO对线粒体功能障碍的影响，根据RNA分析研究了受影响的单个基因。GO-L在40和80μgmL-1时均影响“线粒体功能障碍”途径，而在8μgmL-1时受到影响较小（图5a）。此外，编码线粒体ATP合酶不同亚基的基因以及编码细胞色素C氧化酶不同亚基的基因被下调（图5b）。
此外，由于“肝纤维化”途径也受到GO暴露的影响（图4a），进一步研究该途径中涉及的基因，发现编码胶原蛋白以及促纤维化因子的几个基因胰岛素样生长因子结合蛋白家族中的一部分受到影响，通过胶原蛋白的总分泌也证实以上结果。总的说来，结果表明GO高剂量可能会干扰胶原蛋白的分泌和沉积。
图4. RNA测序数据的IPA分析揭示了暴露细胞中的线粒体功能障碍。A）在40μgmL-1的GO-US，GO-S和GO-L暴露48h后，受影响最大的毒性途径。B）验证研究表明，暴露于指定浓度的GO 2天后，细胞内ATP降低。C）暴露于指定浓度的GO 2天后，线粒体膜电位下降。
图5. RNA测序数据的IPA分析揭示了暴露细胞中的线粒体功能障碍。A）将BEAS-2B细胞在8、40和80μgmL-1GO-L 48 h后，受影响最大的毒性途径。B）8、40和80μgmL-1 GO-L处理的“线粒体功能障碍”途径中涉及的基因。
4 长期接触GO后的转录反应
长期的低剂量GO处理BEAS-2B细胞，细胞活力会适度降低（图1c）。测序结果显示与48h的样品相比， 28天受GO影响的DEG的数量总体上少。值得注意的是，暴露于GO-US（5μgmL-1）的细胞显示出数量最多的DEG，其基因下调程度高于上调的程度。与GO-S和GO-L相比，暴露于μgmL-1的GO-US的细胞显示出更多的受影响基因，如火山图和Venn图所示（图2）。此外，28天的DEG数量超过了7天，以下分析重点关注28天的样本。
4.1 典型途径富集分析
图6显示了在重复剂量分别为1和5μgmL-1的GO-US\GO-S和GO-L暴露28天的BEAS-2B细胞中鉴定出的经典途径的分层聚类分析。分析中仅包含对数变化约为0.5倍和FDR约为0.05的DEG。总体而言，长期低剂量的GO暴露会触发途径的下调（图6）。
图6.低剂量重复暴露于不同横向尺寸的GO后的RNA测序数据的下游分析。
4.2 毒性途径富集分析
使用IPA阐明了长期接触GO所引发的毒性的可能机制。所有3种GO材料都影响了与细胞增殖和/或细胞死亡相关的几种途径，为“肝坏死/细胞死亡”， GO-US、GO-S和GO-L中涉及凋亡调控的几个基因，因此特别针对凋亡基因进行查询，发现了一些属于Bcl-2家族的促凋亡基因，包括BAX、BAK和BAD上调，而属于凋亡蛋白（IAP）家族抑制剂的一些抗凋亡基因（例如BIRC6）被下调（图7a，图7b）。
5 GO对凋亡诱导的长期影响的验证
为了验证图转录组学结果，集中研究了线粒体下游caspase激活的关键调节因子BIRC2（cIAP-1）和BIRC6（Apollon）。如图7c所示，GO暴露导致两种蛋白的表达降低，从而证实了RNA测序结果。评估了暴露于GO 28天的BEAS-2B细胞中的PARP裂解，如图7d所示，三种情况均导致全长PARP的裂解和丢失特别是暴露于GO-US。为了进一步评估GO的长期暴露是否能够触发肺细胞凋亡，使用经典的DNA含量测定法确定了细胞凋亡，流式细胞术分析结果显示了响应GO-US、GO-S和GO-L的剂量和时间依赖性凋亡（图8）。
图7.长期接触GO导致凋亡信号通路的失调。A）对暴露于GO-US（5μgmL-1）的BEAS-2B细胞28天的RNA测序数据的IPA分析表明，线粒体依赖性细胞凋亡途径受到明显干扰。B）（A）中描述的参与凋亡途径的基因的表达水平。C）验证暴露于GO-US、GO-S和GO-L的细胞在1和5μgmL-1下暴露28天，Apollon和cIAP-1的表达减少。D）蛋白质印迹证实胱天蛋白酶活化的PARP裂解（即全长PARP的减少和裂解的PARP的增加）。
图8.长期接触GO会影响肺细胞对细胞凋亡的敏感性。
讨论
本研究首先证明了在研究低剂量细胞对GO的反应方面，RNA测序方法的实用性。在本文没有发现BEAS-2B细胞发生致癌转化的迹象，但短期接触会导致线粒体功能障碍（在没有细胞死亡的情况下），长期接触会影响细胞的凋亡敏感性。先前的研究已经揭示了GO在细胞系HaCaT中对线粒体的显着作用。其他人也报道了GO触发了细胞死亡并伴随着线粒体的下降，其中TGFβ1介导的信号传导在GO诱导的细胞效应中起着核心作用。值得注意的是，本文对GO诱导的转录反应的上游调节子的分析也暗示TGFβ1是BEAS-2B模型中的调节子之一。这里引用的文献中均使用相对大剂量的短期研究。相反，迄今为止很少有低剂量研究发表。
GO富集分析揭示了与细胞外基质相关的基因下调，包括几个胶原蛋白编码基因。此外，GO还显示了两个基质金属蛋白酶（MMP）基因（mmp9和mmp13a）上调。本文人类肺细胞暴露于GO后，一些胶原蛋白编码基因以及MMP9的表达上调。暴露于GO 48小时的BEAS-2B细胞中胶原蛋白的产生相应增加，但在暴露28天时也未观察到任何胶原编码基因的显着上调。因此，MMP上调在肺细胞中GO暴露应答中的作用尚待阐明。GO暴露的肺细胞中胶原蛋白生成的失调可能是细胞对应激的短暂反应。
此外，含有10％胎牛血清的细胞培养基不是肺细胞的天然生物培养基。在先前的研究中，将A549细胞系与原代人支气管上皮细胞（PBEC）进行了比较，显示钯纳米颗粒在PBEC中触发了caspase依赖性凋亡，但在A549细胞系中却没有。本文选择了非致瘤性的BEAS-2B细胞系作为支气管上皮的模型，降低了个体间的差异。
了解纳米材料引起的不同细胞死亡程序的扰动有助于更好地预测这些材料对健康的危害。本文可以证明，从亚微米范围到几十微米的不同横向尺寸的GO能够影响细胞凋亡阈值，从而导致对caspase介导的细胞凋亡的敏感性更高。特别是接触GO会导致不同IAP家族成员的明显下调，包括BIRC2编码的cIAP-1和BIRC6编码的Apollon（小鼠中称为Bruce）。XIAP，cIAP-1和cIAP-2能够直接抑制包括caspase-3等caspase，这与上游的Bcl-2相关蛋白的作用不同。Apollon是一种含BIR（杆状病毒IAP重复）结构域的蛋白，是凋亡和细胞分裂的关键调节剂，本文首次表明低剂量暴露于纳米材料可以引起其转录的下调。通过检测PARP裂解并使用经典的DNA含量测定法确认了caspase介导的细胞凋亡的发生。总体而言，以上结果表明长期暴露于不同侧面尺寸的GO片层会影响人支气管上皮细胞的凋亡阈值。
评论
石墨烯技术的安全和可持续发展要求需要进一步研究人类健康和环境的潜在影响，但长期影响的研究相对较少。本文表明即使在相对较低的剂量下，RNA测序也可用于探测细胞对GO的反应。进一步发现在低剂量、长期暴露与高剂量、短期暴露于不同侧向尺寸的GO的人肺细胞中差异表达基因的模式存在明显差异。对转录组学数据的详细生物信息学分析以及功能验证表明，在没有明显的细胞死亡的情况下，急性暴露导致线粒体功能障碍（细胞应激），而长期或反复暴露于GO则导致对细胞凋亡的诱导逐渐致敏并伴随凋亡基因Bcl-2家族的上调和抗凋亡基因IAP家族的下调。总的来说，目前的发现表明，如果要研究GO的生物学反应，常规的短期检测是不够的，还需要对GO进行长期研究，应该从分析和模型系统的角度重新考虑纳米安全性。
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