平台小知识vol.1：实时荧光定量PCR

分子病理检测需要用到各种先进的数据处理分析仪器和软件，即大多数小伙伴会说的“平台”，在核酸的层面上，对样本进行深度剖析，提炼最需要获得的信息，是这些平台所给予使用者的优质“用户体验”。下面小编会对目前主流的分子检测平台进行简单梳理，第一期介绍实时荧光定量PCR平台小知识。

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什么是实时荧光定量PCR？

这是一种可以实时监控核酸扩增的技术，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化对PCR过程进行实时监控，以此实现对初始模板的定量分析，可简称为qPCR或real-time PCR，但绝非RT-PCR，这是逆转录PCR的意思。

相较于常规PCR，借助电泳对扩增反应的终产物进行半定量及定性分析，qPCR利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最终精确的对起始模板定量分析。

技术发明史

● 1992年由日本科学家Higuchi在报告中提出

● 1996年由美国Applied Biosystems公司推出

技术发展趋势

● 从单一的染料染色法发展到特异性更高的探针法

● 从最初的只能检测单一波长光源发展到可以检测多种波长光源

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常见型号

上文也提到第一台荧光定量PCR仪是由美国ABI（Applied Biosystems）公司推出，因此他们在业界的地位不可撼动。目前应用最为广泛的是ABI 7500 Real-time PCR system，图片左下角这一台，以下简称ABI 7500，是ABI第三代PCR产品，是目前ABI市场占有率最高。

*ABI公司的荧光定量PCR仪器

除了ABI，还有诊断领域的老大哥——罗氏（Roche），荧光定量仪器系列为LightCycler，目前市场占有率最高的是LightCycler2.0。

当然市面上除了两个老大，还有MJ、Bio-Rad等公司，包括国内一些机构也推出了自己的定量PCR仪。

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关键物质

接下来小编将以ABI 7500来展开，上机前的体系配置和普通PCR没什么区别，因为qPCR的关键在于荧光物质的加入，扩增的过程中会产生大量携带荧光信号的PCR产物。所有的定量PCR仪器都有三个共同的组成部分：检测器、光路系统、热循环模块。每个循环结束后,定量PCR仪器通过光学系统记录荧光信号的增加。最后，定量PCR软件计算出数据，用于实验结果的分析。

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技术原理

首先在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线，这样的直线即是基线，这条线是可以自动生成也可以手动设置的。之后反应会进入指数增长期，这个期间扩增曲线具有高度重复性，在该期间，可设定一条荧光阈值线，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般会将荧光阈值的缺省设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的10 倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数被称为CT值，这个值与起始浓度的对数成线性关系，且该值具有重现性。

*对数图谱

 *线性图谱

Ct值最大的意义就是用来计算目的基因的表达量，此时就有两个概念容易被提及，那就是绝对定量和相对定量，绝对定量的目的是测定目的基因在样本中的分子数目，即通常所说的拷贝数。相对定量的目的是测定目的基因在两个或多个样本中的含量的相对比例，而不需要知道它们在每个样本中的拷贝数。

Ct值诚然可以被利用来计算这两种定量结果，但是绝对定量实验必须使用已知拷贝数的绝对标准品，必须做标准曲线。相对定量可以做标准曲线，也可以不做标准曲线。绝对标准品制作困难难以获取，实验室基本都是选择相对定量的方法来计算相对基因表达量。

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检测方法

上文也提到了荧光定量PCR的关键物质——荧光，下面就来说一下PCR产物的荧光标记选择之探针法和染料法。

特异性荧光标记——探针法：

是目前临床最常用的方法，在加入一对引物的同时再加入一对探针，特异性好，这里列举的是TaqMan水解探针：一段与靶基因特异性结合的序列，分别在5’端加入荧光报告基团，3’端加入荧光淬灭基团。其核心是利用taq酶的5’-3’外切酶活性切断探针，使得使荧光报告基团和荧光淬灭基团分离，从而使荧光监测系统可接收到荧光信号，每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步，荧光强度就可代表模板数量。

非特异性荧光标记——染料法：

一般采用DNA染料SYBR® Green I，染料能够与双链结合，发出荧光，它自身也会发出微弱的荧光，应用体系内所有荧光的信号强度与DNA量成正比，所以它对模板没有选择性，且不需要设计复杂的探针，经济实惠。但是也因此暴露缺陷，染料能与所有双链DNA结合，导致非特异性扩增和引物二聚体也会被检测出，并干扰结果。有缺陷就有补救的方法，溶解曲线的分析能帮助操作者判断产物的特异性，溶解曲线是指随温度升高DNA的双螺旋结构降解程度的曲线。单一峰的溶解曲线说明扩增特异性好，有双峰代表出现了非特异扩增或引物二聚体。

报告荧光：6-FAM、JOE、VIC、NED、CY3、Texas RED、CY5
淬灭荧光：MGB-NFQ、TAMRA、BHQ
参比荧光：ROX

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相关应用

目前来讲，基因诊断的主要平台中qPCR应用广泛，在肿瘤的组织样本中检测基因表达量是临床应用的一个方面，其次就是基因分型了，利用taqman探针法针对SNP（基因组上单个核苷酸的变化）设计特异性探针捕获。PCR反应时，加入一对两端有不同荧光标记的MGB特异探针来识别不同等位基因（allele1和allele2），比起一代测序，它整个流程操作简单，准确性高，判读也很方便，认可度高。在做SNP genotyping时特别给力，可以在一个直观的图里展示多个样本的分型结果。

*CYP2D6*17 (1023C.T) TaqMan Assay Genotype Results

针对已知突变，决胜在于检测下限，qPCR可检测出0.1%的突变，在不同细胞系中表现出相同的灵敏度，整个检测流程少于3小时，与一代测序在已知突变的检测上相比有很大优势。

*KRAS G12A突变

其次在融合基因的定性检测上，qPCR可同时检测已知的多种融合基因及剪切体，也能进一步通过制作标准曲线来定量融合基因。下图为慢性粒细胞白血病中BCR-ABL融合基因的定量检测示意图：

*融合基因定量结果=（融合基因拷贝数/ABL1拷贝数）×100%

更进一步，逆转录实时荧光定量PCR （reverse-tranion quantitative real-time PCR，RT-qPCR），目前已作为检测融合基因的常规方法。在实体瘤方向，以ALK融合基因检测为例，同FISH和免疫组化一样，是获得CFDA批准的ALK检测方法之一。

*EML4-ALK使用RT-qPCR检测

上海衡道医学病理诊断中心 利用ABI 7500实时荧光定量PCR平台，开展一系列肿瘤用药指导服务，包括基因分型、基因表达量测定、融合基因定性定量分析等，获取肿瘤患者组织即可进行检测，旨在为患者和医生高效出具临床诊疗指导方案。

 参考资料

[1].Gaedigk A, FreN, Hartshorne T, et al. SNPgenotyping using TaqMan^® technology: the CYP2D6*17 assayconundrum[J]. Scientific Reports, 2015: 9257-9257.

[2].Didelot A, Corre D L, Luscan A, et al.Competitive allele specific TaqMan PCR for KRAS, BRAF and EGFR mutationdetection in clinical formalin fixed paraffin embedded samples[J]. Experimentaland Molecular Pathology, 2012, 92(3): 275-280.

[3].Shaozhang Z, Xiaomei L, Aiping Z, et al.Detection of EML4-ALK fusion genes in non-small cell lung cancer patients withclinical features associated with EGFR mutations.[J]. Genes, Chromosomes andCancer, 2012, 51(10): 925-932.