CRISPR先驱亓磊Science发文：突破性成像技术，让基因编辑“眼见为实”
脱靶效应是阻碍基因编辑技术CRISPR应用的主要障碍之一。如果未能精准编辑目标基因，该技术可能会诱导包括易位在内的染色体重排，从而导致疾病。尽管已有一些技术可用于分析细胞中被脱靶效应影响的DNA，但这些传统方法不仅需要研究人员杀死细胞，且无法获得有关细胞中这段DNA历史和未来的变化信息。因此，科学家们想，有没有一种方法可以实时“看”到细胞中的基因编辑过程，并及时发现脱靶效应，从而开发相应的纠正方法。近日，CRISPR先驱、华人科学家亓磊博士（现为斯坦福大学生物工程系助理教授）在这一研究方向上取得了重要突破，其团队首次开发出了能够在脱靶效应发生时就观察到它们的新技术——CRISPR LiveFISH。相关成果于9月20日发表在顶级期刊Science杂志上[1]。
据斯坦福大学官网报道介绍，作为一种新型成像工具，CRISPR LiveFISH使科学家们首次能够监测CRISPR在活细胞中进行编辑的实时动态，即当CRISPR在活细胞中工作时，实时监测DNA链发生了怎样的变化。
CRISPR LiveFISH中的CRISPR是一种能够实现在活细胞基因组中插入或删除目标基因的技术，FISH全称为荧光原位杂交（Fluorescencein situ hybridization），是一种用于检测细胞内核酸的有效分子技术。不过，单独使用FISH技术时，被检测的细胞需要经历多个步骤的处理，检测无法在活细胞中直接进行。在该研究中，亓磊博士团队将FISH技术的原理与一种修改版的CRISPR进行了巧妙地结合，使FISH技术也能应用于活细胞中。
研究中使用的CRISPR-Cas9技术包括两个主要部分：1）Cas9，这是一种较大的酶，可结合并切断两条DNA链；2）向导RNA（gRNA），它的作用是帮助Cas9找到研究者们想编辑的DNA片段。为了开发CRISPR LiveFISH技术，亓磊博士及其同事使用了两个版本的Cas9-gRNA，一个是标准的用于基因编辑的版本(Cas9)，另一个是经修改后用于成像的版本(dCas9)。
具体来说，第二个版本的Cas9-gRNA经历了两方面的修改。首先，Cas9被失活，使其在结合目标DNA后不切割DNA；其次，失活的Cas9与被绿色荧光标记的向导RNA结合，该标记在荧光显微镜下被激活后会发出明亮的光。
接着，研究小组将两种版本的Cas9-gRNA一同引入到他们的目标细胞中，这些细胞中含有另一种红色荧光标记的蛋白，其特性是会聚集到断裂的DNA周围。
经过这样的设计，绿色荧光会出现在目标DNA区域，当基因编辑在细胞中开始时，红色荧光也会在相同的位置出现。“利用这种方法，我们不仅能够观察到一个DNA链是何时被切断的，也能了解该DNA链被切割、修复了几次。这些信息只要通过追踪绿点和红点就能获得。”亓磊博士解释道。
在该研究中，科学家们还证实，CRISPR LiveFISH这一成像工具的开发对于研究同时编辑两个基因非常重要（很多疾病都是由不止一个基因的多个突变引起的）。在同时编辑（切割）多个基因时，很容易遇到易位问题，即来自一个基因的片段与来自另一个基因的片段连接了起来。
为了证明CRISPR LiveFISH可以实时追踪易位的发生，亓磊博士团队首先设计了两种成像Cas9-RNA，一种携带了被红色荧光标记的向导RNA，另一种携带了被绿色荧光标记的向导RNA，两个向导RNA被设计结合不同的目标基因。接着，他们向目标细胞中引入了这两种不同版本的成像Cas9-gRNA以及可正常切割两个目标基因的基因编辑版的Cas9-gRNA。之后的观察显示，在某些情况下，红点和绿点重叠到了一起，并一起移动，这表明发生了不希望发生的易位事件。
“我们真的在活细胞中实时观察到了基因编辑的过程以及易位的发生。亲眼见到这些非常令人激动。”该研究的第一作者Haifeng Wang说。
亓磊博士认为，CRISPR LiveFISH这项新技术将基因编辑带入了第四维度——时间，可帮助研究者们更好地理解基因编辑过程，并确保单个细胞被正确编辑。此外，如果能将易位可视化，科学家们就能确定哪些方法能将这些事件最小化，这对于相关遗传疾病的诊断与治疗具有重要意义。
资料显示，亓磊于2005年获清华大学学士学位，2007年获加州大学伯克利分校物理学硕士学位，2012年获加州大学伯克利分/加州大学旧金山分校生物工程博士学位，2014年加入斯坦福大学，多年来致力于基因编辑技术与基因治疗领域的研究，是CRISPR技术中国和欧盟专利的共同发明人。
今年1月，亓磊博士入选了2018 年《麻省理工科技评论》“35 岁以下科技创新 35 人”中国区榜单，该榜单认为，亓磊博士的研究不仅重新定义和影响了基因工程，更为基因编辑、基因治疗、药物研发及癌症治疗等众多领域的发展奠定了坚实的科学基础。据悉，本月初，亓磊博士还刚刚入选了Science News评出的十大科学家。
小结
相关论文：
[1] Haifeng Wang et al. CRISPR-mediated live imaging of genome editing and transcription. Science（2019）.
参考资料：
1# New tool helps researchers watch gene editing in living cells（来源：斯坦福大学）
2# 清华之光 | 清华校友亓磊、洪暐哲、陈谐获得2017年斯隆研究奖
4# This year’s SN 10 enjoy the journey, not just the discovery
新靶点
NKG2A | GARP | CD22 | LIF | CDK2 | WWP1 | VCAM1 | Flower | CD24 | Gingipains | DES1 | GPR139 | DHX37 | CXCL10-CXCR3轴 | 628个靶点 | CA19-9
新疗法
双特异性抗体 | PROTACs技术 | 第四代EGFR抑制剂 | RNAi药物 | GCGR抗体 | AMPK激动剂 | 神奇胶囊| CAR-T疗法 | 降胆固醇新药 | 光照+声音 | 调节代谢 | 基因治疗 | 先天免疫 | 细胞治疗 | 智能i-胰岛素 | 胎盘干细胞 | 河豚毒素 | 感冒病毒 | 肠道细菌 | 肿瘤疫苗 | 溶瘤病毒 | 艾滋病毒疫苗 | IL-12 | 纳米颗粒 | 口服胰岛素
新机制
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