哈佛大牛Nature发文：里程碑成果推动「细胞疗法」，治愈糖尿病值得期待
领域：糖尿病
杂志：Nature
亮点：
1）利用单细胞RNA测序，哈佛大学科学家团队分析了超过10万个细胞，描绘了干细胞分化成胰岛样细胞（islet-like cells）的分子步骤；
2）研究发现一种只在β细胞上表达的蛋白质，并借助该蛋白大大提升了细胞混合物中β细胞的纯度；
3）该研究意义重大，让我们离β细胞替代疗法在临床上得以应用，从而改变糖尿病治疗更近了一步。
人体血糖浓度的调控主要由胰岛素和胰高血糖素在多个层次相互制约实现。其中，由胰岛β细胞产生的胰岛素负责促进血糖吸收，降低血糖浓度。胰岛β细胞破坏或功能障碍会导致糖尿病。与长期注射胰岛素不同，胰岛移植通常可以使患者血糖水平在数年内保持正常，并可预防糖尿病的继发性并发症。然而，供者数量稀少限制了这类疗法的应用。
2014年，在一篇Cell论文中[1]，领导这项新研究的Douglas Melton博士实验室首次开创了一种方法，将干细胞转化为产生胰岛素的β细胞。然而，在最初的研究中，β细胞在最终的细胞混合物中只占30%。为了改善β细胞的比例，研究团队希望了解其它70%的细胞是什么。单细胞测序技术的发展帮助攻克了这一难题。（图片来源：Cell）
近年来，一些研究显示，利用衍生自干细胞的胰岛β细胞来替换胰岛中被破坏的β细胞可能会为治愈糖尿病带来希望。5月8日，最新发表在Nature上的一项研究中[2]，哈佛大学Douglas Melton博士带领的科学家团队描绘了干细胞分化成胰岛样细胞（islet-like cells）的分子步骤，为未来生产用于移植的胰岛细胞提供了重要指导。
图片来源：Nature
人类多能干细胞能够无限地自我更新，并在体内产生各种类型的细胞。因为，很多研究团队致力于开发干细胞在体外分化成胰岛细胞的protocols。一个理想的protocol需要实现，促进干细胞分化为完全成熟的α细胞和β细胞；之后，α细胞和β细胞能够被分离、纯化以及重新组装成用于移植的胰岛样结构（islet-like structures）。为了实现这一宏伟目标，科学家们需要透彻理解所有胰岛细胞的分化程序以及胰岛形成的方式。
体外β细胞分化的单细胞RNA测序（图片来源：Nature）
在这项新研究中，Melton博士等分析了干细胞向胰腺祖细胞和激素生产细胞（hormone-producing cells，也叫内分泌细胞）分化过程中不同时间点的超过10万个细胞。细胞的单细胞RNA测序（scRNA-seq）在分化过程的每一步取样，然后进行计算分析，这使得鉴定细胞类型以及通过时间追踪细胞的谱系成为可能。Melton博士等通过这种方法制作了胰岛祖细胞如何发育成分化细胞不同谱系的精美图片（下图）。
人类胰岛细胞的体外分化 | 该研究表明，SC-α和SC-β能够被纯化，再重组产生干细胞衍生的胰岛，用于细胞替代疗法。（图片来源：Nature）
研究人员发现，衍生自干细胞的胰腺祖细胞能够有效分化，但用于处理它们的信号因子组合稍微不同，就会影响祖细胞产生激素表达细胞和非激素表达细胞的比例。
在该研究中，三种最丰富的激素表达细胞类型是来源于干细胞的α细胞 (SC-α)、来源于干细胞的β细胞 (SC-β)以及来源于干细胞的类似于肠嗜铬细胞的细胞(SC-EC)。
研究人员还发现，未成熟的SC-α能够表达两种胰岛激素（胰岛素和胰高血糖素），不过，这种多激素细胞在培养5周后会变成单激素细胞，即变成只表达胰高血糖素的细胞。
SC-EC的特性（图片来源：Nature）
SC-EC的发现令人惊讶，因为肠嗜铬细胞通常存在于肠内（不存在于胰腺中）并产生血清素（有助于调节肠道运动和消化）。当研究人员在分化阶段改变提供给细胞的信号因子组合（鸡尾酒）时，SC-EC/(SC-α+SC-β)的比率变化很大。此外，不同的信号因子组合也会改变非增殖性内分泌细胞/增殖性非内分泌细胞（腺泡细胞和胰腺导管细胞）的比率。
利用CD49a纯化SC-β细胞（图片来源：Nature）
为了制造安全且功能成熟的干细胞衍生胰岛等效物，研究人员必须分离纯化理想的内分泌细胞亚型，然后将其重组为假胰岛（pseudoislets）。在该研究中，科学家们发现，一个简单的分离和聚集程序（一种物理分离法）能够从培养物中去除大多数增殖性非内分泌细胞。此外，他们确定了CD49a (也称为ITGA1 )是SC-β表达的表面分子。结合利用CD49a抗体的磁性细胞分选技术能够使研究者们获得包含80% SC-β的培养物。
经过两步富集后，细胞簇显示出更多的β细胞(粉红色)。（图片来源：Melton实验室）
需要指出的是，虽然该研究可将细胞混合物中β细胞的纯度提升至80%，但科学家们表示，并不一定β细胞纯度越高就越好。控制混合物中β细胞比例的能力是这项研究的关键发现。现在，他们将专注于调查混合物中各类细胞的最佳比例。
“也许我们需要更多其它类型的细胞来帮助调节β细胞，这样它们才能正常工作。我们将找出这些细胞类型是如何相互作用的。”论文第一作者Adrian Veres解释道。
总结来说，该研究中，Veres等重建了人类胰腺祖细胞和分化的内分泌细胞之间的谱系关系，并揭示了这些细胞类型出现的顺序，以及伴随着每个分化轨迹发生的动态分子变化，提供了关于干细胞分化成胰岛细胞深入的机制见解。
那么，我们距离利用β细胞替代疗法治疗糖尿病还有多远呢？目前，已有临床试验在测试移植干细胞来源的胰岛祖细胞到1型糖尿病患者中的安全性和有效性。然而，被移植的胰腺祖细胞仍需要分化和成熟为β细胞来实现由葡萄糖刺激引发的有效胰岛素分泌。但在体内，我们无法控制胰腺祖细胞所接触的信号因子。因此，更理想的产品是，在移植到患者体内前，也就是在体外培养时，细胞就能够响应葡萄糖分泌胰岛素，且在移植到患者体内后，立即发挥作用。此外，值得一提的是，仅移植SC-β并不足以治疗1型糖尿病，因为α细胞对严格控制人类胰岛的激素分泌以及葡萄糖水平的整体调节也至关重要。
Nature的观点文章称，Veres等人在解决一些关键问题方面取得了重大进展。首次，他们提供了详细的scRNA-seq数据集，涵盖了体外胰岛细胞分化的主要步骤。此外，研究的一个关键发现是，SC-α和SC-β能够一起产生，但肠道内分泌SC-EC和增殖性非分泌细胞也会出现。这表明，生产安全的产品需要将SC-α和SC-β分离至高纯度，且为了避免导致癌症的风险，还需要移除增殖性祖细胞。最后，科学家们通过对scRNA-seq数据的详细分析鉴定出了有望进一步改善胰岛细胞分化和纯化过程的新型表面标志物和信号通路。因此，总结来说，该研究意义重大，让我们离β细胞替代疗法在临床上得以应用，从而改变糖尿病治疗更近一步。
相关论文：
[1] Felicia W. Pagliuca et al. Generation of Functional Human Pancreatic β Cells In Vitro. Cell(2014).
[2]Adrian Veres et al. Charting cellular identity during human in vitro β-cell differentiation. Nature（2019）.
参考资料：
1# A map of β-cell differentiation pathways supports cell therapies for diabetes
2# Research boosts the yield of insulin-producing cells for diabetes therapy