什么是逆转录酶?

逆转录酶是从RNA模板合成互补DNA（cDNA）链过程中的必需试剂。因此，深入地了解这些酶的性质及其对逆转录的影响，对分子生物学实验的成功至关重要。

DNA聚合酶活性

逆转录酶是由不同生化活性的不同结构酶组成。尽管不同生物体来源的逆转录酶功能存在或多或少的差异，包括如DNA依赖性DNA聚合酶活性,但逆转录酶的主要功能仍取决于RNA依赖性DNA聚合酶和RNase H酶活性。逆转录过程通常涉及许多步骤：

1.在存在退火引物的条件下，逆转录酶结合到RNA模板并引发反应。

2.RNA依赖性DNA聚合酶活性通过掺入dNTPs合成互补DNA链。

3.RNase H活性降解DNA:RNA复合物中的RNA模板。

4.DNA依赖性DNA聚合酶活性（如果存在)识别单链cDNA作为模板，使用RNA片段作为引物，合成第二链cDNA。

5.形成双链cDNA。

RNase H活性

如上所述，逆转录酶的一个内在特性是RNase H活性。后者可以在合成过程中同时切割RNA：cDNA杂合链中的RNA模板。由于RNA模板在全长逆转录完成之前可能被降解，RNase H活性是长片段cDNA合成过程中需要规避的因素。 RNase H活性还可能降低逆转录效率，这可能是因为其会与逆转录酶中的活性聚合酶竞争。

为了更好地合成cDNA，通过在逆转录酶的RNase H结构域中引入突变，逆转录酶的RNase H活性降低甚至完全消除。这种突变常常可以增加长链cDNAs的产量，促进其合成。

热稳定性

逆转录酶耐受高温的能力是cDNA合成的重要影响因素。升高反应温度有助于使具有坚固二级结构和/或高GC含量的RNA变性，使得逆转录酶能够读取序列。因此，在较高反映温度下的逆转录能够实现全长cDNA合成，产量更高，进而使RNA能够更好地逆转录为cDNA。

与野生型MMLV逆转录酶相比，野生型AMV逆转录酶展现出更高的热稳定性——二者最适宜的温度分别为42-48℃和37℃。一些经过基因工程改造的MMLV逆转录酶可以耐受55℃的高温，但逆转录效率没有明显的改变。这种高度耐热的逆转录酶特别适用于从富含GC的RNA模板合成cDNA。

使用一步法RT-PCR中的基因特异性引物较高温度下的逆转录，增强引物与目标基因结合的特异性。该策略可以在随后的PCR中增加产量和降低背景干扰，使用热稳定性的逆转录酶更适合cDNA合成。

持续合成能力

逆转录酶的合成能力是指结合到酶的单一结合位点中的核苷酸数目。因此，合成能力高的逆转录酶可以在更短的反应时间内合成更长的cDNA链。一些基因工程改造的MMLV逆转录酶在单个结合位点中可以结合多达1,500个核苷酸，结合能力大概是野生型MMLV逆转录酶的65倍。

酶合成能力也与其对模板的亲和力有关。 因此，具有高合成能力的逆转录酶对可能来源于RNA的常见抑制剂具有抗性。 逆转录酶的抑制剂包括来自血液和粪便的肝素和胆汁盐，来自土壤和植物的腐殖酸和多酚，以及来自福尔马林固定，石蜡包埋（FFPE）样品的福尔马林和石蜡。 这些抑制剂通常与RNA结合和/或降低合成活性，高合成能力的逆转录酶能够更好地克服这种抑制。

保真度

逆转录酶的保真度指的是RNA逆转录为DNA过程中的序列精确度。保真度与逆转录错误率成反比。据报道，基于MMLV的逆转录酶错误率在合成15,000到27,000个核苷酸中有一个错误核苷酸，而AMV逆转录酶表现出更高的错误率。

逆转录酶的保真度可能在RNA测序等序列准确度至关重要的情况下发挥重要作用。对于大多数其他情况，逆转录中引入的错误数量可以忽略不计，主要原因有两个：大多数基因短于10 kb，逆转录过程不会放大cDNA中的错误。

末端核苷酸转移酶（TdT）活性

逆转录酶可展现出末端核苷酸转移酶(TdT)活性，这会导致向合成的DNA3′末端非模板特异性的添加核苷酸。TdT活性仅在逆转录酶接触到RNA模板5′末端才会表现出来，此时其会向cDNA末端添加1-3个额外的核苷酸，并且对双链核酸底物（如第一链cDNA合成中的DNA：RNA和第二链cDNA合成中的DNA：DNA）展现出特异性。通常来说，这种内在活性是逆转录过程所不需要的，因为加入的核苷酸与模板不对应。非模版特异性核苷酸加入顺序通常为A>G≥C>T。

不同的逆转录酶具有不同的内在TdT活性。使用野生型MMLV和AMV逆转录酶，25-90%的合成DNA链可能在3′含有额外的核苷酸。另一方面，经过基因改造的MMLV逆转录酶展现出较低的内在TdT活性。除逆转录酶外，核苷酸加入速率还取决于反应条件，如RNA：酶的比例、酶的量、孵育时间和反应温度。

对于特定情况如全长cDNA克隆，cDNA末端的快速扩增（RACE）和RNA测序（RNA-Seq），可以诱导逆转录酶特异性地向cDNA3′末端加入一系列Cs。在高浓度镁和/或锰离子条件下的cDNA合成期间及合成后阶段，这种类型的TdT活性会被触发。结合特殊设计的具有3’Gs(称为模板切换寡核苷酸)的DNA寡核苷酸，TdT活性可以特异性地修饰3’cDNA末端和5′ RNA末端。这些序列修饰的实例包括引入用于随后cDNA合成步骤的限制性位点和/或用于下游RNA测序步骤的接头添加。