厌氧氨氧化：一个关于时间和耐心的故事- 从43年前谈起
1940年12月9日，Gijs Kuenen出生于荷兰阿姆斯特丹西边的小城Heemstede。1972年，Kuenen教授在格罗宁根大学获得微生物学博士学位。毕业后他在美国洛杉矶和荷兰格罗宁根辗转了几年，随后在1980年来到代尔夫特，成为了荷兰代尔夫特理工大学TU Delft的第四任微生物教授。前三人都是代尔夫特理工的传奇人物，包括Martinus Beijerinck、Albert Kluyver和Cornelis van Niel。
Kuenen教授说，每次回想，都让他愈发感觉微生物界各种人和事之间奇妙的联系。他说关于anammox的故事可以从他在格罗宁根大学读本科的时候说起。当时这门课的授课老师是Hans Veldkamp教授(1923-2002)，Veldkamp的导师则是Albert Kluyer (圈子的传承)。在为期六周的微生物课里，他学会了如何对多种微生物和代谢类型进行富集培养，而这种方法正是TU Delft首任微生物教授Martinus Beijerinck发明的。后来Veldkamp教授则成为了Kuenen教授博士学位的导师。他的博士论文是关于两种硫氧化菌(SOB)的比较。在此后很长的一段时间里，他的研究都是围绕SOB展开的。在1980年他回到Delft之后，他开始寻求SOB在工业上的应用。巧合的是，当时荷兰瓦赫宁根大学的Gatze Lettinga教授正在研究污水的厌氧处理技术。两位教授联合本地一家叫Paques的小公司，成功地开发了生物脱硫工艺，去除污水中的硫化氢，并回收单质硫。Paques公司后来也将这项工艺技术商业化，取名THIOPAQ。取名者正是Kuenen和Lettinga联合培养的博士生Cees Buisman，后来他也成为了瓦大环境系的教授。关于硫细菌更多的故事，大家可以回看IWA微信公众号此前的推送文章《生物脱硫技术的前世今生》。
在大学当教授之余，当时Kuenen每周会抽几小时给一家叫Gist-Brocades (GB)的生物公司当咨询顾问。1987年，GB公司请他为公司一套新的污水厌氧处理系统的硫循环做技术指导。这套系统本来是要用来解决工厂产生的臭气问题的。但在此期间，GB公司的运行人员却发现系统中一个奇怪现象——中试运行数月后，反硝化反应池的氨氮浓度下降了，硝酸盐也减少了，还有明显的氮气产出。“书里不是说氨氮只能在好氧条件才会转化吗？反硝化池的氨氮浓度应该保持不变才对啊？”时任GB公司研究员的Arnold Mulder对此十分不解。他通过领导找到了 Kuenen教授进行咨询。
Mulder先生的发现唤起了Kuenen教授尘封了10年的记忆，他告诉Mulder：“我10年前就看过一篇paper报道过这个现象。” Kuenen教授指的是1977年67岁的奥地利理论化学家Engelbert Broda写的题为《Two kinds of lithotrophs missing in Nature》（德语原题《Zeitschrift für allgemeine Mikrobiologie》）的文章。此文在当时学术圈可谓一声惊雷。当时37岁的Kuenen也拜读了这篇文章，并和同事们展开讨论，但他们大都认为氨是不可能在厌氧条件下被氧化的。
两人开始了进一步的研究。很有商业意识的Arnold很快给这个潜在工艺起了一个朗朗上口的名字——ANAMMOX（厌氧氨氧化）。然而，他们初期的尝试并不算成功：他无法通过传统的培养富集法提取出这个反应发生的微生物，因此无法确定这是一个自发的化学反应，还是一个生物反应。
Kuenen此时又想起了奥地利人Broda的文章里列出的两条热力学方程式：
Kuenen教授提议用15-N同位素示踪技术来确认氮气是否来自氨氮，并将此重任交给了他的一位女硕士生——Astrid van de Graaf。Astrid在实验室用流化床反应器做实验，成功发现了14,15-N2。这个发现固然让人激动万分，但他们还需要更多的证据来充分印证这个反应的生物属性。幸运的是，Kuenen教授向荷兰技术基金会（STW）申请到资金为Astrid专门开设一个博士项目，确保后者可以安心将研究进行下去。
在证明生物反应的存在后，Astrid接下来要继续用15-N示踪标记法识别各种中间物和最终产物，并尝试富集反应的微生物。这项工作的挑战巨大，别的不说，单考虑到Anammox菌超慢的生长速率(约0.001-0.002/h)，Astrid的工作量就可想而知。她的勇气也值得钦佩。幸好皇天不负有心人，在一次偶然的尝试中，他们发现anammox反应的基质是亚硝酸盐，而不是硝酸盐，而且部分亚硝酸盐会转化成硝态氮用于固定二氧化碳。
Kuenen教授在1980年入职TU Delft后的20年可以算是厌氧氨氧化的第一个20年。这个阶段以验证anammox为焦点，在热力学方程式为指导，最终通过富集培养、流化床反应器、同位素示踪标记等手段证明了anammox的存在，并描绘了基本的代谢路径。
Astrid在完成她的博士学位后，并没有选择继续anammox的研究，1994年，在Delft当了6年研究员之后，她选择到荷兰科学中心NEMO做科普内容方面的工作。Kuenen教授将下一个挑战交给了Marc Strous博士，让他对anammox菌进行富集提纯。利用SBR反应器，Marc成功地可重复地培养高产量的anammox菌，纯度提高至70％。
有了高纯度的微生物，Kuenen教授的团队可以做更多分析了。他找到澳洲昆士兰大学的分子生物学教授John Fuerst帮忙确认目标微生物。借助电子显微镜的近距离观察，他们发现这些细胞有一个奇怪的、靠膜隔开的内室。这可是一个大惊喜！要知道，只有更复杂(真核)细胞才有这种隔室，就像人类细胞拥有的细胞器（organelles）。他们将这个东西取名厌氧氨氧化体(anammoxosome)。这些细胞器负责执行特定的生物学功能，对细胞组分、代谢过程和信号传导途径起时空控制作用。简单的原核细胞和细菌都没有细胞器。目前科学家只知道浮霉菌（Planctomycetes）具有这种结构，因此研究团队推断anammox菌属于该门。
话说浮霉菌非常奇特，因为它同时含有细菌、真菌和古菌三大菌属的特性，因此有些人认为该菌在早期可能跟三大菌属是同一个祖先。只是DNA的研究将它们归在了细菌属一类。可以说，浮霉菌的出现模糊了细菌的定义。在此之前，没有人将浮霉菌门跟厌氧氨氧化拉上关系，但Kuenen教授的团队用氨氮和亚硝态氮培养出了这种细胞，底物也随反应过程消失。这也从侧面说明anammox菌的特别之处。
这个说个题外话：他们将这个第一次测序分析的anammox菌取名Candidatus Brocadia anammoxidans：anammoxidans表示其独特的生化特性，Brocadia既表示了这些细菌的发现地(Brocades)，另外也因为这些鲜红色的细菌让研究者联想到明艳的织锦。
“21世纪是生物的世纪。”这句话虽然更多被拿来揶揄，但在我们看来，到本世纪再来看，它所表达的可能就变成真知了。就以anammox为例，在2000-2020年之间，关于它的许多新发现都有赖于生物技术的进步。
16S rRNA基因测序的普及帮助科学家对更多的anammox菌进行命名。例如Mike Jetten和Michael Wagner就说服法国基因测序中心Genoscope帮Kuenen团队在一个流化床反应器的富集物进行DNA，并找出了新的菌种，并以Kuenen的姓命名(Candidatus Kuenenia stuttgartiensis)。测序结果也显示基因组相当大(4.27 Mb)，还含有大量细胞色素基因，这也解释了anammox菌呈红色的原因。
这也开启了anammox菌的宏基因组分析时代。随着DNA测序技术的发展，Kuenenia菌的基因组通过Mike Jetten教授带领的团队得到进一步完善。Jetten团队开展大量的生物化学和酶学研究，在anammox的代谢路径方面取得了重大突破。例如通过结构分析发现anammoxosome是能量转化的场所，又例如发现一氧化氮才是许多anammox菌的反应中间物(而不是羟胺)。
可以说，21世纪以来，厌氧氨氧化研究已经遍及各个方面，从基因组学、蛋白组学、环境和生态微生物学。值得一提的是，虽然实验和分析手段在过去20多年有了很大改进，不过时至今日，科学家依然无法得到纯种的anammox细菌，这也是为什么这些菌目前都以Candidatus命名。Kuenen表示希望他的学生以及学生的学生们可以早日得到单菌株，这样就可以摘掉Candidatus的前缀。
Kuenen教授在文章最后说道：“对作者而言，这个故事就到此为止了。但欣慰的是，微生物学的奇妙旅程仍将继续。”这是一个没有终点的探索。相信在下一个20年，厌氧氨氧化的研究还有很多惊喜值得期待。
参考资料