【文献解读】文献204：染色体不稳定性及核型在肿瘤进化中的改变
Pervasive chromosomal instability and karyotype order in tumour evolution
Nature, 2020.09.02
本研究来自：
TRACERx & AstraZeneca；Charles Swanton Thomas B. K. Watkins
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背景
肿瘤染色体不稳定性含染色体数量和结构的动态变化。体细胞拷贝数突变（SCNAs）造成的多样性，是肿瘤进化过程中的重要变化。
本研究通过分析来自22个癌种394个肿瘤组织1,421个样本的SCNAs，发现染色体连续的不稳定性变化会导致SCNAs的异质性。并行进化事件，导致37％的肿瘤中都有不同亚克隆中的相同基因（例如BCL9， MCL1，ARNT（HIF1B），TERT和MYC的破坏）的突变发生。多数高频缺失都发生在全基因组加倍之前，在49％的肿瘤中作为克隆性事件发生。但即使在全基因组加倍的肿瘤中，人类白细胞抗原（HLA）的杂合性缺失和染色体8p的染色体的拷贝数缺失也作为亚克隆事件反复出现，这些染色体层面的变化均表明核型重塑的发生。位于染色体1q21（BCL9、MCL1、ARNT基因），5p15.33（TERT），11q13.3（CCND1），19q12（CCNE1）和8q24.1（MYC）的高频扩增区段，在单个样本中多为克隆性事件，但在多样本进化分析中，则通常为亚克隆事件。在1,024个转移性样本的独立数据集中的分析结果发现，在转移性样本中有13个SCNAs区段的富集现象，含在透明肾细胞癌中的8q24.1染色体区段（含MYC基因）的扩增，在HER2 乳腺癌中的11q13.3染色体（CCND1基因）的扩增等。
染色体不稳定性会对SCNAs的连续发生有影响，SCNAs被认为在整个肿瘤进化过程中通常为并行发生的有序事件。
方法
染色体不稳定性（CIN）是由细胞分裂过程中染色体分离错误引起的。CIN与预后不良相关，并可能引起SCNAs等进化选择的底物 。
然而，肿瘤进化后期中CIN的影响，以及克隆性和亚克隆性SCNAs的时间顺序与全基因组加倍（WGD）事件及转移性传播的关系尚不清楚。
研究队列及方法
研究对22个癌种的394名患者的1,421个肿瘤组织样本进行了多样本定相SCNAs分析（每个肿瘤样本中位数为3个样本；每个肿瘤样本范围为2–16个样本），从单倍型水平上分析SCNAs异质性。使用MEDICC 软件对每个肿瘤组织的拷贝数状态和最近共同祖先（MRCA）进行评估，得到SCNAs的亚克隆状态。该研究的1421份样本中，1019个为肿瘤的原发灶，32个为治疗后的肿瘤原发灶，7个为局部复发后肿瘤组织，363个为转移灶组织。每个肿瘤至少有两个样本，152个患者同时至少有一个原发灶和至少一个转移灶样本。
亮点
1、文章通过对多种类型肿瘤样品进行样本定相和体细胞拷贝数改变（SCNAs）分析，揭示连续染色体不稳定性导致的SCNAs异质性。
2、文章验证SCNAs在肿瘤细胞中普遍持续存在，并倾向于作为有序事件发生，这对肿瘤的发展和转移有重要的作用
结果
结果-1：泛癌种中的CIN变化及SCNAs异质性
图1 不同癌种体细胞拷贝数异质性
为了探索肿瘤进化过程中的CIN改变，该研究定量分析了SCNAs在基因组中发生的总比例，以及克隆性的早期SCNAs与亚克隆性晚期SCNAs的比例（图1a-d）。研究对每个肿瘤中的克隆性SCNAs进行鉴别（图1c），发现99％的肿瘤（394/39）至少具有一个亚克隆性SCNAs（图1b）。基因组中克隆性SCNAs占比中位数为26％，亚克隆性SCNAs占比18％。在45％的肿瘤中，亚克隆SCNAs覆盖超过20％的基因组，该结果表明CIN的变化是普遍且不断进行的。但此结果对CIN评估并不全面，因为该研究为多区域采样，所以单个测序结果只能反映每个肿瘤部分的数据情况。该研究发现，每个肿瘤分割的样本数量与SCNAs异质性显著相关。三阴性乳腺癌、食道腺癌和透明细胞肾细胞癌的分析结果显示，在这些癌种中，中位纯度（图1e）与亚克隆SCNAs的基因组占比显著相关，表明肿瘤纯度可能会影响对SCNAs克隆性的评估。
结果-2：SCNAs的进化
图 2 定向选择改变 SCNAs景观
为了研究SCNAs景观受中性进化或选择进化的影响程度，该研究将抑癌基因（TSGs）和原癌基因密度比定义为OG–TSG score，在染色体臂层面，分析肿瘤进化过程中每个染色体臂扩增或缺失与OG–TSG score的相关性；发现OG–TSG评分与克隆性拷贝数变化（图2a）以及亚克隆性拷贝数变化（图2b）均显著相关。
为了研究每个肿瘤内的亚克隆SCNAs动态变化，研究评估了前期研究中用到的多个核型模型。以每个肿瘤的染色体臂的拷贝数为起点，比较不同模型间预测和实际亚克隆肿瘤核型的差异（图2c）。研究比较了一下三个模型：加权模型（使用相对OG-TSG评分，对具有较高致癌性或肿瘤抑制倾向的核型进行校正）、中性模型（默认染色体臂随机变化）、加扰模型（随机赋予各染色体臂OG–TSG分数）。研究发现，相比于其他两个模型，加权模型可以更准确地预测亚克隆SCNAs的进化轨迹。
这些数据均表明，原癌基因和抑癌基因的相对失衡，会驱动CIN发生，从而使持续选择成为可能，而WGD可能支持在肿瘤发展的后期进一步的基因组重构。然而，在该研究队列中，仍有41％的患者中性或加扰模型性能优于加权模型，可能不同的肿瘤类型应该有特异性的权重模式。同时，发现在WGD肿瘤中，亚克隆选择的表现性能更好（在64％的WGD，59％的亚克隆性WGD和54％的非WGD肿瘤中，加权模型的表现优于中性或加扰模型），这与WGD在肿瘤演化中为转化事件的结论相一致（图2d）。
结果-3：克隆性SCNAs的进化
为了将SCNAs进行早晚期发生时间的定位，研究通过GISTIC2.0软件，将至少两个肿瘤样本均发生的SCNAs定义为多次发生的SCNAs。将这些发生SCNAs的染色体区域，在时间轴上定义为：早期，中期或晚期（图3a、b）。早期峰区域的SCNAs可能与肿瘤发生有关；中期或晚期峰区域的SCNAs可能参与肿瘤的持续进展。
早期事件中，克隆性SCNAs的频率超过了克隆性点突变和小插入或缺失（indels）突变的频率（图3b）。17p13.3-q11.2号染色体上的缺失峰（含TP53基因）在13个癌种中的9个中均被定义为早期事件，仅在KIRC中被定义为晚期事件（74％为亚克隆性）。在HER2 乳腺癌、肺鳞状细胞癌（LUSC）和三阴性乳腺癌（TN BRCA）中，超过90％的肿瘤在17p13.1号染色体上出现克隆性杂合性缺失（LOH），这表明染色体缺失在这些癌种的发生中是必要事件。在多个癌种中，92％的发生了WGD的样本中，TP53基因的LOH都是克隆性事件；表明TP53基因 LOH可能对WGD具有耐受性。
染色体3p26.3–p12.1和VHL区域的缺失或LOH，在KIRC患者中定义为早期事件（98％的KIRC样本中为克隆性LOH）。其他癌种中高频克隆性区域还含：HER2 乳腺癌中的染色体17q12-q21.2区域（包含 ERBB2基因，61％的发生率，其中82％为克隆性事件）；LUSC染色体3p区段的LOH（100％的发生率，97%为克隆性事件）；LUAD染色体7p11.2区域的扩增（含EGFR基因，63％发生率，其中72％为克隆性事件）。
图3
研究认为，在WGD之前发生的基因组缺失，会导致次等位基因完全缺失的LOH事件。相反的，在WGD之后发生的缺失，不会导致LOH。在整个队列中，94％的克隆性缺失与早期含LOH的缺失共发生，这表明高频克隆性缺失事件通常在WGD之前。
其他区域的发生时间在不同的癌种中是不同的。例如，包含FAT1基因的染色体4q35.2区域的缺失，在三阴性乳腺癌（发生率88％，克隆性事件占比80％）为早期事件；在ER 乳腺癌中为中期事件（发生率58％，64％为克隆性事件）；而在HER2 乳腺癌中则为晚期事件（发生率61％，27％为克隆性事件）（图3b）。
结果-4：亚克隆性SCNAs的进化
研究进一步分析了肿瘤进化过程中的高频亚克隆性SCNAs。高频扩增区域含染色体1q21.1–q21.3（含BCL9、MCL1、ARNT基因）和5p15.33–p15.32（含TERT基因），在不同癌种中发生的早晚期时间不同。在LUAD中，在80％患者中染色体5p15.33–p15.32区域的扩增为克隆性事件；而在KIRC（76％）、ER 乳腺癌（89％）和神经胶质瘤（90％）中，染色体5p15.33–p15.32区段扩增则为亚克隆性事件。在LUSC患者中，TERT基因的扩增发生时间与片段长度和扩增程度相关；大多数扩增倍数较低的为染色体臂水平的克隆性扩增（13/21），而扩增倍数较高的为区域性的亚克隆性扩增（10/11）。这可能反映了进化过程中基因剂量的增加，低水平的TERT增益在无性系中选择，随后在肿瘤发展后期的癌细胞子集中选择高水平的扩增。
在13个癌种中，染色体19p12-q12的扩增（含CCNE1基因）在其中的10个癌种中定义为中期或晚期事件。CCNE1的高度扩增（扩增倍数大于2×）与WGD相关。在20个发生了克隆性WGD的肿瘤中，有9个发生了亚克隆性的CCNE1扩增；这表明CCNE1扩增既可能发生在WGD前也可能在WGD事件之后。
本研究的394个肿瘤中有146个（37％）存在SCNAs的平行进化，说明肿瘤内不同亚克隆事件趋向于相似的进化方式（图3c）。平行扩增比非平行亚克隆扩增区段更大（P = 7.1×10 -3，effect size = 0.1）。最高频的平行扩增区段有染色体1q21.3–q44（包含BCL9、MCL1、ARNT等基因）、 5p15.33（包含TERT基因）、以及8q24.1区段（包含MYC基因）（图3c）。最常见的平行缺失区段有染色体14q（14q32.33（含ASPP1基因）和14q11.2（含NDRG2基因））；10q和9p区段等。
图4
同一等位基因的克隆性的WGD事件后，依然会发生亚克隆性LOH通过事件。队列中22％发生了WGD的患者中，在HLA区段（6p21.3）中出现了一个清晰的亚克隆性LOH峰；表明在亚克隆中发生了WGD后相同等位基因的两个拷贝的丢失事件 。之前研究发现，HLA LOH在NSCLC、KIRC、乳腺癌、膀胱尿路上皮癌、子宫内膜癌和食管腺癌中作为亚克隆性事件普遍存在。而SKCM的HLA LOH率较低（0％为克隆性事件，3％亚克隆性事件）。SKCM中最普遍的克隆性扩增区段为染色体臂的6p区， 该区域不仅包含HLA基因，在6p24.2区域还包含NEDD9这一影响黑色素瘤转移的基因，这些基因可能会影响HLA缺失。
在二倍体肿瘤细胞中，任何缺失都会导致LOH。发生LOH后遗留的等位基因，如果发生了WGD，等位基因发生复制和重复，总拷贝数仍为2。研究发现在染色体区域8p23.3–p12发生克隆性缺失的患者中，发生了WGD的样本中，单倍体LOH的染色体区段仅存在一个拷贝。染色体8p23.3–p12区域的缺失在乳腺癌中发生率最高，这种缺失与染色体剂量效应有关，并且会影响脂质代谢和肿瘤转移。
结果-5：晚期新发亚克隆突变可能影响转移
最后，研究探讨了SCNAs与转移之间的关系。与之前的研究一致，与肿瘤原发灶样本(366例）相比，转移灶组织样本(178例) 发生SCNAs的基因组比例更高(P = 5.3×10−3，效应值= 0.25)。与肿瘤原发灶组织相比，在转移组织中SCNAs为克隆性事件的比例更高。在所有22 (5例 ER 、5 例HER2 、2例TN BRCA；以及5例KIRC、2例LUAD、1例SKCM 、1例乳头状肾细胞癌和1例肺癌)有多个原发灶肿瘤组织和配对的转移灶组织样本的患者中，发现这些SCNAs在原发灶肿瘤组织中多为亚克隆性，但在转移组织样本中全为克隆性事件。
图5
为了评估基因SCNAs在转移中发挥的作用，该研究对74个有配对的原发灶肿瘤样本和转移组织样本的患者进行了配对分析，并结合癌症基因组图谱(TCGA)的2631例原发肿瘤样本和来自哈特维格医学基金会(HMF)的1024例转移性肿瘤样本进行非配对分析，对四种类型的转移性肿瘤(HER2 乳腺癌、ER 乳腺癌、LUAD和KIRC) 中观察到不同的SCNAs转移扩散模式进行了研究。发现在ER 乳腺癌、HER2 乳腺癌和LUAD中，与原发灶肿瘤组织样本相比，在转移灶中富集的高频染色体臂水平事件主要为克隆性事件。相反，在KIRC中，原发灶肿瘤样本与转移组织样本间共有的LOH比例很低，转移样本中富集的多数高发的染色体臂水平事件为亚克隆性事件。在ER 乳腺癌和HER2 乳腺癌中，染色体1 p36.23-p36.12区段的缺失（含EPHA2基因）为早期事件, 染色体17p13.3-q11.2区段的缺失（含TP53基因）则为晚期事件，在转移性肿瘤样本中富集。在LUAD中，两个早期缺失事件的区域（染色体17p13.3-q11.2 (含TP53基因)和染色体19p13.3（含STK11基因))，均在转移组织中有显著富集现象，说明肿瘤进化中的这些早期事件可能有助于肿瘤转移。
其他在转移组织中富集的染色体区域（如HER2 乳腺癌患者中14q32.33、6q21（含PRDM1基因）、6q14.1和10q26.3（含MGMT基因）区域的染色体缺失；KIRC患者中4q35.2（含FAT1基因）、9p24.3–p21.1（含CDKN2A基因）区段的缺失，和8q21.3–q24.3（含MYC基因）染色体区域的扩增等）被分类为中期或晚期事件（图5）。
结论
本研究发现肿瘤进化中普遍存在持续进行的CIN，这可能反映了整个肿瘤发展过程中基因组层面的持续优化。揭示了对肿瘤发展过程中早期和进化中获取的SCNAs进行研究的重要性；以及评估SCNAs对转移过程的潜在影响的重要性；同时揭示了染色体在肿瘤发展不同阶段中的改变，这些发现为将来肿瘤患者的治疗和预后，提供了潜在的优化策略。
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