学习时间丨测序技术简介及对比——二代测序

▍内容参考/优医智库

▍作者/学者 方海英

导 读

二代测序技术由于其解决了原有测序技术的弱点，一跃而上成为了基因测序应用的新宠。其最大特点在于，测序通量达到了数量级的提高；得益于其通量提升，测序的边际成本显著下降，因此，以人类基因组为代表，对大量基因进行序列的测序成本也产生了指数下降的成果。

了解你手中的工具，是迈向成功必不可少的环节。在基因检测上，了解测序相关的技术及其特点，并在合适的情境下运用合适的技术，是在保证检测有效性的前提下将总体成本最优化的必备技能之一。

图 1测序技术发展历程与技术比较^[1]

前面的两期已经对一代测序技术之中的qPCR以及桑格测序做了初步介绍。两者虽然足够满足基本的分子病理学检测或基因测序需求，但是对于多基因的综合测序分析就开始力不从心；并且如果规模进一步扩大，成本与时间的指数增长就成为了一代测序的阿喀琉斯之踵。

根据美国国立卫生研究院（NIH）国家人类基因组研究院（NHGRI）的数据，人类全基因组测序计划于1990年立项，耗时13年才得以初步完成，耗资达到27亿美元^[2]。在该项计划初步完成之后，如何缩短测序所需时间，降低测序成本，就成了一个重要的发展方向。在NHGRI发起的降低测序成本的计划刺激下，发展出了一系列的二代测序技术（NGS）。

图 2每百万碱基DNA序列测序成本演变^[3]

对于大规模的基因组测序来说，2011年时间点上，桑格测序法的平均成本为每百万碱基约500美元，而二代测序已经将平均测序成本压到了每百万碱基0.5美元以下^[4]。目前，二代测序技术已经将人类基因组测序成本压到了1000美元，上机测序时间48小时以下^[5]。

二代测序技术相比于一代测序而言，总体上有数个共通的，大的改进。首先，比起一代测序主流上通过细菌质粒克隆的方法对DNA碎片进行前期克隆处理，二代测序普遍使用了无细胞系统进行NGS建库的前期准备；这样可以排除质粒中克隆载体序列的干扰^[6]。

图 3常见二代测序技术解决方案流程说明^[7]

其次，相比起一代测序最多上百的并行测序量，二代测序技术的并行测序量产生了数个数量级的提升；在NGS中，并行度能从数千直至数百万。再次，测序结果的读取不用经过电泳过程，而是在碱基合成或类似过程中直接测序；该过程可以在循环且大批量的过程下进行^[6]。上述两点对二代测序技术的通量提升做出了极大的贡献。

NGS技术的具体实现方式有许多差异，例如最早的NGS，由现属于罗氏旗下的454生命科学所推出基于乳化PCR+焦磷酸测序法的NGS；以及现今行业中流砥柱，对NGS技术发展与测序成本降低的推动做出关键技术贡献的Illumina所推出的基于桥式PCR扩增+荧光染色可逆终止物的NGS；抑或是测序行业另一巨头Thermo Fisher旗下Life Technologies所提供的NGS解决方案，均是达成同一目标的不同策略^[8]。

Illumina测序方案原理解说

在二代测序的技术及解决方案之中，不得不提到一家企业，就是国内的华大基因。华大基因的二代测序方案来源自Complete Genomics与2009年提出的技术概念^[9]。2013年Complete Genomics被华大基因收购，华大基因对其成果进行了进一步的改良与优化，于2015年推出了自己的BGISEQ-500平台^[10]，从此也作为参与者进入了二代测序的大舞台。虽然是后来者，表现却相当出色：其MGISEQ-2000平台能在成本远低于Illumina HiSeq 4000的情况下产出一致性相当高的测序结果^[11]。因此也是备受青睐。

二代测序从此设计上就是参照先前测序手段的短板，无论是潜在干扰的排除还是总的测序通量，均进行了针对性的优化与改进，但这并不代表二代测序技术是完美无缺的。比起一代测序，二代测序的读长普遍较短，因此其测序结果需要使用专门的工具进行处理，并且在测量具有重复序列的基因时可能存在偏差^[12]。

目前针对这一问题，主要是通过桑格测序法对二代测序进行验证来确保结果有效。而为了解决这一问题，开发出的单分子测序技术，即三代测序，在保证高通量的同时达到了长读长，并且无需前期PCR扩增即可进行测序^[13]；三代测序目前仍在完善之中，因此目前技术上最好的选择仍然是二代测序的解决方案。

图 4一代测序与二代测序在成本有效性上的对比^[14]

除去技术因素，进行二代测序的仪器与分析软件等的购置，即固定成本，相比一代测序的各类技术，仍然相对高昂。但是当测序量增长时，其边际成本上升相对较慢，因此在测量大量基因序列时，二代测序才开始体现成本优势。

综上，二代测序可以满足目前诊断医学上的绝大多数需求，尤其是多基因测序，全外显子测序，全基因组测序等综合性应用上，二代测序的价值是无法替代的。

表 1常见基因检测技术对比

参考文献：