一篇31分的高分文章带你了解单细胞分析如何做功能验证的研究思路！
现今，单细胞分析逐渐成为生物医学研究的标配，但是只有单细胞数据分析的研究很难投入高分期刊了，搭配了功能实验进行全面综合验证研究的文章才能进入审稿人的眼界呢！今天我们一起来学习这种模式“单细胞分析+功能实验验证”的高分文章，马上把研究思路及方法get起来！文章名为：Interactions between cancer cells and immune cells drive transitions to mesenchymal-like states in glioblastoma，它利用单细胞 RNA 测序分析并结合功能实验剖析了胶质母细胞瘤中肿瘤微环境的相互作用。
Mario L. Suva博士的实验室一直在专注于脑肿瘤的生物学，特别是成人和儿童的高级别弥漫性脑胶质瘤；Itay Tirosh博士的实验室专注结合计算和实验方法来研究人类肿瘤。他们的研究paper可以在Cancer Cell 发表，说明是强强联合的结果了。胶质母细胞瘤是一种普遍致死的脑癌，尚无有效治疗方法。了解胶质母细胞瘤的细胞互作对于预测治疗中的细胞行为和发现异质性关键调节因子至关重要。已有研究应用scRNA-seq揭示胶质母细胞瘤中的四种细胞状态：神经祖细胞类（NPC -like）、少突胶质细胞祖细胞类（OPC -like）、星形胶质细胞类（AC -like）和间充质样细胞类（MES -like）, 并在TCGA- MES肿瘤中发现MES与肿瘤中巨噬细胞丰度增加有关，但是并未明确胶质母细胞瘤中出现 MES 类癌症状态的原因，并且细胞外在因素对癌症或免疫细胞的任何潜在作用仍有待阐明。
为了探究胶质母细胞瘤的间充质亚状态的发现，作者们就开始了此文章工作，先跟着摘要图来了解下研究思路：作者利用胶质母细胞瘤的小鼠模型和 gliomasphere 模型来证明巨噬细胞如何在体内和体外诱导胶质母细胞瘤出现MES 样细胞状态，结合单细胞受体配体、细胞间互作分析找出了相互作用的受体配体对，巨噬细胞衍生的制瘤素 M(OSM) 及其受体（OSMR 或 LIFR，与 GP130 复合）在胶质母细胞瘤细胞上激活 STAT3 信号传导来诱导 MES 样状态；然后在小鼠的功能实验中验证了此受体配体，并在类MES细胞的模型中，验证了巨噬细胞和胶质瘤（GBM）互作的受体和配体；还在恶性细胞和巨噬细胞中发现了类MES的状态，类MES的GBM细胞与浸润性 T 细胞的丰度和细胞毒性增加有关。其具体的研究流程，见下图。
巨噬细胞诱导胶质母细胞瘤转变为MES 样状态
图 1
作者利用公共的单细胞和bulk的胶质母细胞瘤数据探索TCGA胶质瘤三种亚型和各细胞类型的关系，发现TCGA-MES 特征在 MES 样癌细胞中高度表达，而且在免疫细胞中也高度表达，包括巨噬细胞、小胶质细胞，以及T 细胞。这说明胶质母细胞瘤中巨噬细胞和间充质类细胞之间存在关联（图1A）。为了确定巨噬细胞是否在体内引起胶质母细胞瘤细胞的 MES 样状态，他们利用了由 GFP、HrasG12V 和 sh-p53慢病毒诱导的小鼠胶质母细胞瘤模型，通过scRNA-seq分析此细胞模型，细胞模型的表达模式，特别是MES样和OPC样状态模式，与胶质母细胞瘤患者的表达模式高度一致（图1B）。通过小鼠细胞模型建立的MES 样状态细胞的标记，发现 MES 样胶质母细胞瘤细胞（PDPN+PDGFRa GFP+ ) 与免疫细胞 (CD45+) 的丰度成正比（图 1C），使用泛巨噬细胞标记物 IBA1/AIF1 的免疫组织化学分析进一步表明，与 OPC 样细胞相比，巨噬细胞在 MES 样胶质母细胞瘤细胞附近富集（图 1D）。到此，构建的小鼠模型中巨噬细胞和MES 样胶质母细胞瘤细胞高相关性已经实锤了，但是为了进一步支持这种关联，作者又选择了患者样本 MGH157 作为肿瘤的代表，通过 scRNA-seq分析，确定该肿瘤样本包括了胶质母细胞瘤的基本细胞状态和细胞类型。在来自 MGH157 的两个组织切片的原位富集中，说明MES 样胶质母细胞瘤细胞与巨噬细胞相邻（图1E）。为了进一步确定这种关联是否对MES 样胶质母细胞瘤细胞存在影响，作者将巨噬细胞消耗剂（氯膦酸盐）注射到小鼠移植模型中 ，观察到氯膦酸盐处理后PDPN+PDGFRα-GFP+MES 样胶质母细胞瘤细胞的百分比降低（图 1F），说明巨噬细胞的表达影响MES 样状态的胶质母细胞瘤细胞的生存。
巨噬细胞分泌的配体诱 MES 样状态
图 2
利用已发表脑胶质瘤单细胞数据集进行了配体受体互作分析，发现巨噬细胞高度表达的五种配体（AREG、GAS6、HBEGF、OSM 和 PDGFB）和它们的相应受体（AXL、EGFR、OSMR 和 PDGFRB）在胶质瘤恶性细胞中高度表达（图2A），但是与其他恶性状态相比，巨噬细胞衍生的四种受体中的三种（AXL、OSMR 和 PDGFRB）在人类肿瘤中优先由 MES 样癌细胞表达，在scRNA-seq 和 TCGA 数据集中都是这样（图2B）。在小鼠模型的验证中，五种配体中的只有两种（Osm 和 Hbegf）的过度表达导致 MES 样细胞丰度增加（图 2C）。因此，Osm 和 Hbegf 是巨噬细胞表达的配体，可在小鼠模型中诱导体内胶质母细胞瘤MES 样状态的富集。
在体外人类细胞中重现 OSM 诱导 MES 样状态
图 3
在人类细胞中是否能重现巨噬细胞诱导胶质瘤母细胞瘤向MES类状态的转变呢？强强联合的作者们又达到此目的，在体外又构建了人胶质瘤母细胞瘤模型，通过 scRNA-seq 分析了四个胶质母细胞瘤胶质瘤模型（MGG23、MGG75、MGH143 和 MGG18），说明构建的细胞模型可以表征在患者肿瘤中观察到的细胞状态（图3A，B）。与我们在小鼠模型中的观察结果一致，用 OSM 处理后 CD44+ MES 样细胞增加（图3C），OSM 处理导致 MES 样细胞比例增加（图 3D）。
STAT3 通过 OSMR/LIFR-GP130 复合物诱导 MES 样状态
图 4
用 OSM 处理后， CD44 的诱导在 OSMR KO 细胞中部分降低，但在 OSMR 和 LIFR 的双重 KO 或 IL6ST 的 KO 中完全消除（图 4A 和 4B）。相比之下，LIFR 或 IL6ST KO 消除了用 LIF 处理后 CD44 的诱导，但 OSMR KO 没有消除（图 4A 和 4B），这表明 LIF 对 MES 样状态的影响是由 LIFR/GP130 介导的异二聚体复合物。用来自人巨噬细胞或小胶质细胞的条件培养基，或 MGG23 与人巨噬细胞的共培养，观察到类似的 CD44 诱导（图 4C、4D）。说明OSM 在很大程度上足以重现巨噬细胞在MGG23 细胞里诱导 MES 样状态的转变。为了研究 OSM 诱导 MES 样状态的潜在机制，作者探究了靶向 8 种转录因子小干扰 RNA 的影响，这些因子先前被发现用于调节胶质母细胞瘤的间充质状态（CEBPB、STAT3、RELA、 TAZ、FOS、JUN、TEAD2 和 TEAD4)，通过用 OSM 或 BSA 处理后耗尽每种转录因子，然后使用Bulk RNA-seq对 MGG23 细胞进行分析，观察到STAT3 的消耗消除了 OSM 诱导的 MES 样基因表达，使得这些基因的表达在 OSM 和 BSA 处理后相似（图 4E）。因此，OSM 介导的 MES 样状态的诱导主要通过 STAT3 介导。
胶质母细胞瘤关联巨噬细胞的间充质状态
图 5
虽然巨噬细胞诱导胶质母细胞瘤细胞的状态转变，但它们也可能受到这种相互作用或胶质母细胞瘤微环境中其他元素的相互影响。为了探索这种可能性，作者比较了胶质母细胞瘤巨噬细胞与其他胶质瘤的巨噬细胞的 scRNA-seq ，未检测到 MES 样恶性细胞的类别，包括 IDH 突变型星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤和 H3K27M 神经胶质瘤。主成分分析的前两个主成分（PC1 和 PC2）突出了胶质母细胞瘤巨噬细胞与其他胶质瘤巨噬细胞之间的差异（图 5A）。这表明胶质母细胞瘤巨噬细胞显示出与其他胶质瘤中的巨噬细胞不同的程序，定义了一种新的巨噬细胞间充质 (MP-MES) 状态（图 5B）。但是，当比较细胞巨噬细胞评分，观察到与其他神经胶质瘤相比，胶质母细胞瘤中 MP-MES 特征的表达要高得多（图 5C）。相反，作者从患者数据集（图 5D）以胶质母细胞瘤小鼠模型（图 S5E）中观察到每个胶质母细胞瘤内巨噬细胞的 MP-MES 评分存在相当大的变异性。作者观察到MP-MES 的这种变异性与 MES 样胶质母细胞瘤细胞相关，无论是跨同一肿瘤的空间区域（图 5E）还是跨不同肿瘤。
MES 样状态可能与 T 细胞激活有关
图 6
作者的分析表明 TCGA-MES 肿瘤内的T细胞富集（图 1A），T 细胞富集可能与抗肿瘤活性的增加或减少有关，为了探究T细胞状态，作者进一步检查了 T 细胞特异性基因与 MES 样基因的相关性。与 T 细胞总体丰度相关性高的基因（CD2、CD3D、CD3E 和 CD3G 估计）也与肿瘤的 MES 样评分具有更高的相关性，反映了 T 细胞丰度与 MES 之间的总体关联 类似状态（图 6A）。然而，主要组织相容性复合体 I 类（MHC-I）和 MHC-II 类的基因在 MES 样胶质母细胞瘤细胞（以及 AC 样细胞）中的表达显著高于 NPC 样和 OPC 样细胞（图 6B）。为了测试胶质母细胞瘤细胞状态对 T 细胞介导的肿瘤杀伤的影响，作者建立了人类 T 细胞和 MGG75 细胞系之间的共培养系统，利用细胞模型设计了表达 NY-ESO-的 MGG75和表达组织相容性白细胞抗原的原代人类 T 细胞。共培养后MGG75 细胞有效地激活了工程化的 T 细胞，通过 T 细胞活化（CD25 和 CD69）、脱粒（CD107a）和耗竭（PD-1）的markers（图 6C）所测量。为检测 MES 样细胞对T 细胞反应差异性，作者在共培养前用 OSM 处理 MGG75 细胞，并再次观察到 T 细胞活化和 T 细胞介导的杀伤增加（图 6C、6E、S6D）。表明T细胞介导的胶质母细胞瘤细胞杀伤可能对 MES 样状态更有效，并且通过 OSM 诱导胶质母细胞瘤细胞向 MES 样状态转变可以促进这一过程。
单细胞分析是全文的分析手段，但是和它明显和其它单细胞分析文献的模式截然不同，加了实验模型的研究结果是不是逼格一高，让你一开始没看懂呢，没事！冷静下来多读几遍！功能实验的体内体外模型构建与验证反复推进，让我们理解了胶质母细胞瘤向间充质样（MES）状态转变的肿瘤微环境作用机制，此文献的出色点：单细胞个性定制分析（受体配体互作）、公共数据的验证分析、细胞模型或动物模型实验验证，一定也要把这些运用在你的单细胞研究课题中。