NMN保健食品含量检测方法

方法1（参考中国中医科学院中药研究所一篇专利中的方法）

氢核磁定量分析技术测定NMN绝对含量

NMN的分子量为334.22，其化学结构式如(图1)，NMN为内盐化合物，很难通过HPLC手段对NMN的含量进行准确检测，所以采用核磁定量应当考虑溶剂对样品和内标的溶解性，溶剂不能与样品发生化学反应，溶剂峰不能遮挡样品峰。NMN在水溶解度较好，不易溶于有机溶剂，所以选择重水作为氘代试剂，溶剂的选择对核磁共振分析具有重要意义。

包括以下步骤：

(1)、测定NMN和内标物对苯二酚在溶剂氘代水中的定量峰，NMN定量目标峰为NMN中δ8.89的质子峰，内标物对苯二酚的定量目标峰为内标物中δ6.67的质子峰；

(2)、设置核磁共振波谱仪的参数，包括脉冲宽度5.5μs、驰豫延迟时间4s、采样温度25℃、采样次数16次，将内标物对苯二酚87.07mg溶于氘代水(重水)25mL中，得内标物对苯二酚溶液；取内标物对苯二酚溶液0.7mL，加入NMN，待完全溶解后，装入核磁管中，上机测试，得到图谱后，进行相位和基线调整；

(3)、测定含有NMN的样品和内标物对苯二酚的定量目标峰的相对积分面积，得到NMN相对于内标物的质量比为1︰1.255～7.453，具有良好的线性关系，积分面积是将定量目标峰值积分5次，积分数值除去最大值和最小值，取中间三个值的平均值，得到积分面积；

(4)、根据内标物的质量，计算NMN的质量，然后计算NMN的纯度，即得NMN的绝对含量，NMN绝对含量的计算公式为：

式中Ws为NMN样品的质量，As和Ar分别为NMN样品定量峰和内标定量峰的积分面积；Es和Er分别为加入的样品和内标物的质子当量质量，相对分子量除以定量峰质子数；Wr为加入的内标物对苯二酚的质量。

所述的NMN的分子量为334.22，化学分子结构式为：

NMN的氢核磁共振氢谱归属为：δ：9.37(s,1H,H-1)，9.20(d,1H,J＝5.7Hz,H-2)，8.89(d,1H,J＝8.0Hz,H-3)，8.23-8.17(m,1H,H-4)，6.13(dd,1H,J＝5.8,2.3Hz,H-5)，4.56(q,1H,J＝2.6Hz,H-6)，4.48(dt,1H,J＝5.7,3.7Hz,H-7)，4.37(dt,1H,J＝5.4,2.3Hz,H-8)，4.26-4.20(m,1H,H-9a)，4.10-4.04(m,1H,H-9b)。

所述的内标物对苯二酚的分子结构式为：

对苯二酚的色谱峰归属为δ：6.67(s,1H)。

参考专利信息：

【申请（专利权）人：中国中医科学院中药研究所

公开（公告）号： CN110658224A

专利名称：《一种氢核磁定量分析技术测定NMN绝对含量的方法》】

方法2（参考一篇文献）

液质联用法测定NMN含量

仪器、试剂与材料

仪器：4000Qtrap 串联三重四级杆线性离子阱质谱仪（美国AB Sciex 公司），LC-20AD 高效液相色谱仪（日本Shimadzu 公司），Milli-pore 超纯水仪（美国

Millipore 公司），超声波（宁波新芝），万分之一天平（梅特勒公司），蠕动泵（Hamilton 公司）。

试剂：甲醇（色谱纯，默克公司），超纯水，Beta-烟酰胺单核苷酸，乙酸（色谱纯），1 mL医用注射器，0.22 μm 微孔滤头（上海安普）。

仪器条件

色谱条件：岛津Shim-pack VP-ODS（150 L×2.0，5 μm）色谱柱，样品室为室温；流动相：A 为0.1%的乙酸水溶液，B 为含2 mmol/L 醋酸铵的甲醇溶液；流速为0.3 mL/min，柱温箱温度为40 ℃，进样量为10 μL。梯度洗脱条件：0 min B 与A 体积比为5∶95，3 min B 与A 体积比为35∶65，5 min B 与A 体积比

为100∶0，8.1 min B 与A 体积比为5∶95，12 min程序结束。

质谱条件：采用电喷雾（ESI）离子源，在正离子电离模式下选用多反应离子监测（MRM）扫描模式进行定量分析。电喷雾电压5500 V，离子源温度为500 ℃，离子源辅助气GS1/GS2 气流均为50 L/h。

色谱分离条件优化

用质量浓度为28.5 μg/L 的NMN 标准溶液和岛津Shim-pack VP-ODS 色谱柱来优化洗脱程序及试剂。其他条件相同时20%甲醇水等度洗脱是20%乙腈水信号

的2~3 倍，因此选用甲醇水组合洗脱；对比20%甲醇水等度洗脱和12 min 梯度洗脱，梯度洗脱分离效果更好，色谱图中可以区分出同分异构体。

标准溶液配制：精确称取NMN 标准品0.0285 g，用超纯水溶解后定容至50 mL 容量瓶，得到570 mg/L的NMN 标准储备液。用超纯水逐步稀释成228、114、57、28.5、14.25 μg/L 浓度梯度的标准溶液。

参考文献：【李东芹. 液质联用法测定蔬菜和水果中的烟酰胺单核苷酸[J]. 实验技术与管理, 2019, 036(009):57-59,72.】

方法3（参考一篇SCI文献）

高效液相色谱检测NMN含量

在Hewlett-Packard 1100上使用Supelcosil LC-18-T 15 cm×4.6 mm柱 (Supelco, Bellefonte, Pa.)进行高效液相色谱。

缓冲液A ：含100 mM KH2PO4（水溶液），pH值为7.5。

缓冲液B ：含80%的100 mM KH2PO4（水溶液），pH值为7.5，含20%的甲醇。

洗脱条件为 ：100%缓冲液A  0至7分钟，100%缓冲液A至100%缓冲液B  7至8分钟，100%缓冲液B  8至13分钟。流速为1毫升/分钟。

在这些条件下，以下化合物易于分离（括号内为出峰时间）：NMN（2.38分钟）。

参考文献：【Mehl R A,Kinsland C,Begley T P,Identification of the Escherichia coli nicotinic acid mononucleotide adenylyltransferase gene.[J] .J Bacteriol, 2000, 182: 4372-4.】