酶促Diels-Alder反应

Spinosyn A是一种大环内酯化合物，其生物合成具有四种合成酶——spnF, spnJ, spnL 和 spnM，为了研究spnF、spnL和spnM的功能，研究人员在大肠杆菌BL21(DE3)*中异源过表达了相应的基因，并将其产物纯化为N端组氨酸标记蛋白(纯度>95%)。

利用色谱学技术，将各个基因表达产物与反应物混合，检测各组分的保留时间。可以看到，底物多烯在SpnM存在下，发生环化得到Diels-Alder产物3，因此SpnM催化的步骤必定在3→8之间。同理，SpnF催化的反应步骤应当在5→8之间。

随着SpnM浓度的增加，脱水步骤的速率增加，而环化速率不受影响。观测数据最符合积分速率方程(1a)和(1b)，它们分别模拟了脱水步骤的Michaelis-Menten动力学和环化步骤的一级动力学。

从上面的实验结果，我们可以推理出这一系列酶的作用机制和反应顺序：