Cellular & mol immu：从氨基酸水平揭示新冠病毒特异性抗体反应规律

当前全球新冠疫情局势依然严峻，感染人数接近1.2亿，致死人数接近260万人（截至2021年3月9日）。疫苗是控制疫情、终结病毒传播最值得期待的手段。疫苗是通过诱导宿主免疫系统，产生针对相关病毒的特异性抗体或诱发T细胞免疫而发挥免疫作用。目前，已有12款疫苗获得批准上市（https://covid19.trackvaccines.org/）。同时，作为一种RNA病毒，新冠病毒在持续发生突变，引起重大关注的包括D614G突变株、英国突变株、南非突变株以及巴西株等，在这一背景下，有一个急需回答的问题：面对这些突变株，已经上市的疫苗能否为接种人群提供足够的保护？

全面、系统地了解体液免疫（抗体）对新冠病毒的响应规律，可能为上述问题提供答案。陶生策团队联合佛山第四人民医院等多家单位，前期利用蛋白芯片在蛋白水平解析了体液免疫对新冠病毒的响应规律（Nature communications 2020, 11, 3581.）；利用S蛋白小肽芯片，在小肽水平初步解析了体液免疫对新冠病毒的响应规律（Cellular & molecular immunology 2020. 17(10): p. 1095-1097；Cellular & molecular immunology, 2021）。2021年3月4日，上海交通大学陶生策团队、华大基因等多家单位于Cellular & molecular immunology在线发表研究成果：Systematic profiling of SARS-CoV-2 specific IgG epitopes at amino acid resolution。该研究基于高通量抗体表位解析技术AbMap（Molecular cellular proteomics 2020），从氨基酸水平揭示了新冠病毒特异性抗体反应规律，确定了引发体液免疫的关键氨基酸残基。

作者首先利用该团队发展的高通量抗体表位解析技术AbMap，以新冠患者康复血清为直接输入样本，完成了55例样本中抗体表位的解析。结果显示：与新冠病毒相关的表位在不同个体间存在较大差异；不同蛋白间的免疫原性不尽相同；直接以血清为输入样本时有效解析到的与新冠病毒相关的表位较少。

康复血清中，除了新冠病毒相关的抗体外，还存在大量与新冠病毒不相关的抗体。这些与新冠病毒不相关的抗体，降低了AbMap的灵敏度和特异性。为了解决这一问题，作者采用生物素化的RBD、S1、S2以及N蛋白等，从康复血清中富集靶向对应蛋白（或结构域）的抗体，然后采用AbMap解析对应抗体的表位。结果显示：经蛋白富集之后，能够显著提高所获表位的数量及质量。

图1 蛋白富集能够显著提高AbMap的灵敏度和特异性

作者进一步将所获表位定位于S蛋白的3D结构上，并统计每一表位出现的频次：在S蛋白中存在两个非RBD的热点区域；表位几乎都位于S蛋白的表面；表位中的关键氨基酸残基在其他几种冠状病毒中高度保守。另外，还发现6个高频突变位点为表位中的关键氨基酸残基，这些可能是潜在的中和抗体靶标。

图2 所获表位在S蛋白上的分布情况

为进一步验证所获表位的正确性，作者采用丙氨酸扫描的策略，依次突变表位所在位置的氨基酸，构筑小肽芯片：结果表明在与抗体相互作用中，表位中的关键氨基酸残基发挥重要作用，进一步验证了蛋白富集抗体的必要性。

图3 相关表位的分析及验证 A. 新冠病毒相关表位；B. 表位在S蛋白晶体结构上的位置；C. 不同冠状病毒的同源性分析 D. 小肽芯片验证

此外，使用RBD富集的抗体，其表位位于ACE2和RBD结合区域的附近，与多种中和抗体类似。用N蛋白富集的抗体，也解析到一系列单个氨基酸分辨率表位，其热点区域位于N蛋白的C端附近。

总之，本项研究将新冠特异性抗体反应规律的揭示推进到了单个氨基酸水平，相关结果将有助于中和抗体研发、疫苗研制、效用评估以及逃逸突变鉴定等，助力新冠疫情防控。

本研究的第一作者为上海交通大学祁环博士，马明亮博士生，江何伟博士，山东大学凌建亚教授，中国科学院大学陈凌云博士生，通讯作者为上海交通大学陶生策研究员，李华副研究员，赵小东研究员。