近年来，吸入新药的开发逐渐获得药品生产企业的重点关注。对于肺部疾病，因肺泡表面积巨大、血气屏障较薄、代谢酶较少、血流丰富，药物可以迅速吸收，吸入药物更可以直达靶部位，而口服或静脉途径给药后仅不到5%的药物可到达肺部,全身暴露水平高毒性风险大[1]。口服药物开发需要满足Lipinski 五倍率法则，而吸入药物分子允许低水溶性及低生物利用度[2]，显示出吸入给药的独特优势。吸入药物需要药械配合，在化学、制造和控制（Chemical Manufacturing and Control，CMC）及吸入装置方面的开发要求高、难度大。非临床研究中，吸入新药的毒理实验及仿制药的刺激过敏等实验的气溶胶发生、试验操作、结果分析及毒性评价等也存在一系列挑战。我国的创新一类吸入药物项目尚少，评价经验还需要进一步积累。本文结合实际工作中的体验及对相关问题进行的调研，对吸入药物非临床毒性评价的特点进行了梳理，以供研究者参考。
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技术要求
1.1 吸入给药模式临床有粉雾剂、气雾剂、喷雾剂、软雾剂等不同的吸入剂型，其递送方式及效率各不相同，临床给药方式也各有不同。不同的吸入制剂在非临床阶段可以采用的给药方式仅有气管内给药及吸入给药，气管内直接给药具有给药剂量精确、用量小的特点，但只适于早期药效毒理的初步评估，因气道内给药时上呼吸道没有药物暴露，无法评价其安全性，不适于正式的毒理试验[3]。对动物吸入给药可采用全身暴露及口鼻暴露两种模式，全身暴露模式因为药物消耗较大、存在非吸入途径吸收等问题逐渐被人们舍弃，目前一般推荐采用口鼻吸入给药模式。吸入试验与其他途径相比最大的特点在于给药系统复杂、设备要求高、过程复杂及影响因素多。目前我国还没有针对吸入药物非临床评价的技术要求，国外仅经济合作与发展组织（Organization for Economic Co-operation and Development，OECD）有吸入药物非临床试验技术指南[4]。非临床研究中要实现准确给药，通常需要开发动物专用的吸入器以模拟临床给药，匹配毒理试验要求。生物药吸入制剂对稳定性的要求较高，非临床试验中药物气溶胶的产生是一个难点。1.2 吸入药物粒径吸入给药过程中，药物气溶胶颗粒能否被吸入肺部并在肺部沉积很大程度取决于气溶胶的空气动力学粒径。气溶胶颗粒的空气动力学粒径是颗粒随气流运动能力的特征参数，以气流中具有相同沉降速率的单位密度球形颗粒粒径表示，用于描述在重力作用下颗粒在气流中的沉降情况。只有具有足够小的空气动力学粒径的药物气溶胶才可能随着吸气进入肺部。在大鼠吸入毒理试验中，当药物气溶胶粒径介于1~4mm 时，随粒径增大，口咽部及气管的气溶胶沉积量会轻微增加，同时肺部的药物沉积量相对稳定；当粒径大于4mm 时，气溶胶颗粒在口咽部及气管的沉积量明显增大，而肺部的沉积量则急剧减少[5]；而当粒径过小（<1μm）时，气溶胶则会随呼气呼出。粒径较小的颗粒会主要沉积于肺泡，难以发挥针对气管的药效作用。有报道，轻微哮喘患者吸入药物适合的粒径应为2.8μm，表明粒径范围选择对不同疾病的重要性。啮齿类动物的呼吸道解剖结构与人差别较大，导致气溶胶的沉积分布差别也较大；而犬及非人灵长类肺部的气溶胶沉积分布特征与人更为接近。在毒理学实验中，推荐的气溶胶颗粒空气动力学中值直径（median mass aerodynamic diameter，MMAD）数值应介于1~4mm，而几何标准差（geometric standard deviation，GSD）应介于1.5~3 之间。有药学研究表明，在吸入毒理学实验中仍然需要伴随进行气溶胶粒径的检测，确保药物气溶胶可以被动物吸入。气溶胶空气动力学粒径的检测方法首选基于质量检测的碰撞法，而其他物理方法需要与碰撞法对比，只有当验证其适用性后才可用于试验[4]。目前粒径检测的“金标准”是基于高效液相色谱（high performance liquid chromatography， HPLC）等分析方法进行质量计算的级联碰撞法。激光飞行法属于光学方法，使用过程中难以区分药物与辅料，无法做到对活性药物成分（active pharmaceutical ingredient，API）的准确定量，尤其对于干粉制剂中的辅料乳糖颗粒的结果干扰较大，该方法不适合使用。1.3 递送剂量与沉积剂量吸入给药与其他给药途径的明显区别在于，吸入药物是由动物伴随呼吸动作主动吸入的，这带来几方面的问题：①剂量无法准确定量，只能估算；②动物的状态与呼吸模式会改变吸入的药量；③即使估算了递送剂量，实际吸入的气溶胶药物在被吸入后可能紧接着就被呼出，无法完全沉积并被机体利用。吸入实验中剂量的表述包括递送剂量和沉积剂量（递送剂量指气溶胶经发生后经动物吸入的气溶胶药量，沉积剂量指吸入的气溶胶最终沉积在肺部的药量）。递送剂量的计算公式为：Dose=RMV×C×D×F/BW（RMV：动物的每分钟通气量，C：吸入气溶胶的浓度，D：吸入的持续时间，F：可吸入的气溶胶颗粒比例，BW：体重）。此公式适用于从大鼠到犬等不同的动物。国际吸入毒理学会（AIT）对该公式中的参数进行了规范：RMV=0.608×BW 0.852[6]。与估算法不同，有的实验室实际检测动物的每分钟通气量，然后代入公式计算，该方法实际操作难度大，设备要求高。对毒理实验资料中的数据进行分析，实际检测的每分钟通气量用于计算剂量与公式估算的剂量结果接近。为提高给药剂量，可分别提高气溶胶浓度或延长给药持续时间[5]。每个吸入药物由于处方和发生装置的差异，能实现的最大气溶胶浓度各不相同，但通常有一定限度。因此，通过延长给药时间以最大程度地提高给药剂量是更现实的做法。出于动物福利的考虑，在重复给药毒性实验中，最长的持续给药时间一般不超过6 h/d[7]。鉴于气溶胶药物的不稳定性，吸入毒理学实验中应对递送剂量的稳定性进行检测，定期取样，计算递送剂量的偏差范围。根据OECD 的指导原则，此偏差范围不应超过20%[7]。药物的递送剂量是估算剂量，实际能沉积在肺部的药量即沉积剂量才更接近起效剂量。沉积剂量除受到动物呼吸频率、潮气量、气道解剖结构及药物粒径的影响外，也受到动物种属因素的影响。不同动物种属的药物沉积比例也不同。一般认为，大鼠体内递送剂量的10%可最终沉积到肺部，而犬体内递送剂量的25%可实现沉积[8]。通常基于这个固定比例对吸入毒理学实验中的沉积剂量进行粗略估算。沉积剂量并非药物最终的起效剂量。沉积于肺部的药物颗粒将面临黏液-纤毛清除系统的外排作用，有的药物在吸入后会有80%~90%的药量被外排至口咽部直至胃肠道[9]，此时胃肠道吸收成为吸入毒理学实验中伴随的吸收途径，只有未被外排的存留药物经溶出并被吸收后才能进入机体真正起效。临床上可以采用令患者吞服活性炭的方法来检测药物经胃肠道的吸收情况；但在非临床吸入毒理学实验中，存留剂量由于受到药物颗粒的分布、溶出及气道生理状态等因素的影响，实际上难以估算。准确给药是吸入毒理实验的首要条件。要实现给药剂量的准确与均一，在实践中需要：①进行充分的预实验，对受试物气溶胶的发生特点有充分了解，准确控制影响参数；②实验前对动物进行充分驯化，令其熟悉接受吸入给药的保定环境，减少给药过程中的应激，对于不适应的动物要及时剔除；③实验过程中进行密切的浓度检测、环境检测，对任何可能导致异常的因素及时修正。1.4 环境参数药物气溶胶是一个处于持续变化中的不稳定体系。在给药过程中维持稳定的药物气溶胶持续递送对准确给药非常关键，但不能确保准确给药。气溶胶药物是经由动物主动吸入的，而动物的自主呼吸容易受环境因素影响，如在应激情况下动物呼吸模式可能浅而快，而在安静状态下通常慢而深，不同的呼吸模式会导致吸入的气溶胶的量产生差异。这种动物的个体差异通常无法有效监测，可能对试验结果带来影响。在口鼻吸入模式下，动物受到强制保定，应激反应较大，可能改变呼吸模式。异常的温湿度，过低的氧气或过高的二氧化碳，均易导致动物呼吸模式改变，进而改变给药剂量。为解决上述问题，①需要在实验前对动物进行驯化，令动物熟悉保定条件，减少应激；②需要在给药过程中监测各种环境参数，确保温度、湿度、氧气、二氧化碳等参数处于适当范围，确保在设定的保定条件下无异常环境应激。内容由凡默谷小编查阅文献选取，排版与编辑为原创。如转载，请尊重劳动成果，注明来源于凡默谷公众号。
