人-胸腺肿瘤组织细胞悬液制备流程

背景介绍

胸腺属于中枢淋巴器官，分左右两叶，表面有薄层结缔组织被膜。被膜结缔组织呈片状伸入胸腺内部形成小叶间隔，将实质分割成许多不完全分离的胸腺小叶。每个小叶都有皮质和髓质两部分，皮质内胸腺细胞密集，髓质则含较多胸腺上皮细胞。胸腺瘤起源于胸腺上皮细胞，是最常见的前上纵隔原发性肿瘤。

对于胸腺瘤组织的单细胞悬液一般使用美天旎公司的肿瘤组织试剂盒制备。

胸腺组织示意图

实验仪器及耗材

实验步骤

1. 准备肿瘤解离试剂盒的酶混合液，将100µL的H酶、500 µL的R酶和25 µL的A酶加入到4.4mL RPMI 1640培养基中。

2. 组织切成直径2-4 mm的小块。

3. 将组织转移到含有酶液的gentle MACS C 离心管（冰上）。

4. 拧紧C管，并将其倒挂在gentle MACS 解离器的套管上。

5. 运行gentle MACS解离器中的h_Tumor_01程序。

6. 程序终止后，将C管从gentle MACS解离器上拆下。

7. 使用MACS mix试管旋转器在37℃下连续旋转C管30 min。

8. 将C管倒挂在gentle MACS 解离器的套管上，并运行gentle MACS解离器中的h_Tumor_02程序，随后将C管置于MACS mix试管旋转器上在37 ℃下连续旋转30 min。

9. 程序终止后，将C管从gentle MACS解离器上拆下。

10. 去上清后使用RPMI重悬细胞沉淀，使用置于50 mL离心管上的70 μm滤膜过滤。

11. 用20 mL RPMI 1640培养基冲洗滤膜，收集滤液后300g离心7 min，尽可能去上清液。

12. 使用适当体积的缓冲液重悬细胞，使用台盼蓝血细胞计数仪分析细胞数量和活性。

13. 检测细胞活性，活性在85%以上可用于后续测序实验。

制备结果

注意：尽量选取新鲜的肿瘤样品进行操作，肿瘤离体时间多长免疫细胞容易死亡。影响最终的实验效果。