NCBI引物设计

以人的β-actin基因为例尽量详细的介绍目前设计QPCR引物的方法

查找基因

Actin基因的基本信息如下

找到mRNA序列，注意正常设计引物一般以NM号开头的为准，XM多数为用生物信息学的方法预测的到的转录本信息。Actin只有一个NM号

正常Qpcr设计引物尽量设计在CDS区，actin的CDS信息为193-1320

点击右侧的Pick Primers

如果需要引物设计在CDS区则把相应的选定范围标注在相应的选择框内，如下图：

正常QPCR引物一般设计小于200，我个人一般习惯100-200之间。红色标注为扩增产物大小，蓝色圈出为设计的引物数量

一般情况下QPCR引物尽量选择跨外显子设计这样可以避免因为提取RNA过程中基因组DNA没有去除干净引起的非特异扩增的产生。红色标注为选择必须扩外显子设计。

另外还需选择比对的数据库以及种属，因为之前是从mRNA的界面直接进入的设计引物界面，所以该部分默认的与之前mRNA 的界面一致。

点击get primers，另外个人比较习惯让设计的引物显示在新的页面中，所以可勾选Show results in a newwindow选项，这样如果前面有选项错误可重新选择。

热腾腾的引物就这么出来了，下图显示的是该序列的整体信息及引物在整个序列中的位置

下面显示的就是第一对引物的详细信息。一般引物本事比较需要关注的就是红色标记的几个值尽量小于4，蓝色标记为引物跨的外显子的位置，这里边反应的是引物主观上的好坏

下图为该对引物比对到的相关的非特异的其他的一些序列，需要注意比对到的非特异序列，这里反应的是引物在整个数据库中的客观的好坏。

引物的选择要综合考虑引物的自身主观的质量和客观特异性最终做出选择。

根据不同的实验要求对引物也有不同的要求，当然最终评价引物好坏还是要以最终的实验结果为准。