新辅助化疗前后测序、单细胞测序成就10 CCR

Changes in peripheral and local tumor immunity after neoadjuvant chemotherapy reshape clinical outcomes in patients with breast cancer

新辅助化疗前后乳腺癌患者肿瘤免疫浸润程度的改变以及与患者预后之间的关联分析

1.数据

本文所需的三组患者均接受新辅助治疗（NAC）并有治疗前后组织的测序数据。

2.新辅助化疗前后的免疫改变

研究者首先对患者新辅助化疗前后的免疫变化进行研究，对于那些不完全响应的患者而言，sTILs浸润较高与总生存时间和无复发生存时间显著延长有关（图1A）。

为测量NAC诱导的肿瘤免疫微环境的转录变化，研究者使用nanoString对770个免疫相关基因治疗前后的转录变化进行分析(n=83)。不同亚型治疗前后基因表达变化如图1B所示，大部分TNBC患者在NAC后免疫基因发生表达下调（图1C），表明NAC对TNBC中的免疫基因起到表达抑制作用。

图1. 新辅助化疗前后的免疫改变

3.NAC诱导的免疫基因表达变化与TNBC预后

基于TNBC患者治疗前后免疫相关基因的改变（转录后-转录前的表达改变值）分别进行总体生存时间(OS)和无复发生存(RFS)时间的单因素cox回归分析，11个基因的上调与RFS的改善相关，1个基因的上调与更差的RFS显著相关，大量基因的上调与OS延长，少数与OS缩短有关（图2A）。CDH1上调与生存时间延长有关，CD70下调与生存时间延长有关（图2B）。

图2. NAC诱导的免疫基因表达变化与TNBC预后

在单个基因表达变化的基础上，为提高对高维数据的解释，研究者通过将多个基因压缩成通路或定义其功能来降低维度。首先将单基因表达数据转化为生物信息学分类的免疫特征得分(该类别中所有基因的log2表达值的总和)，并对该通路免疫特征得分的变化与生存时间的关联进行分析（图3A）。其中，T细胞激活和NK细胞通路得分上调和预后较好（OS，RFS）相关（图3B）。在其他类型乳腺癌患者中没有观察到这种现象。

图3. NAC诱导的免疫特征得分变化与TNBC预后

4.NAC对肿瘤和外周血T细胞克隆和功能的影响

T细胞响应的特征是抗原特异性T细胞的寡克隆扩张，因此研究者对NAC前后患者T细胞克隆的数量(多样性)和扩增T细胞克隆的存在情况进行研究。为进一步研究治疗对T细胞克隆和功能的影响，研究者收集4名乳腺癌患者(包括2名TNBC)在NAC前后的外周血单细胞(图4A)，并对细胞进行分选。在TNBC患者中，经TCR刺激后能够表达多种细胞因子的多功能性的PD-1-HI CD8+ T细胞比例在NAC后升高(图4B)，ER+乳腺癌患者的PD-1-HI CD8+细胞群在NAC后出现功能下降或停滞(图4B)。在NAC后，ER+HER2+患者的T细胞功能几乎完全丧失。TNBC患者PD-1-HI CD8+细胞产生的细胞因子主要是效应因子和化疗吸引因子(图4C)。通过TCR测序分析NAC前后血液中的PD-1-HI CD8+和PD-1NEG CD8+ T细胞。虽然各样本检测到的T细胞数量一致，但在PD-1-HI CD8+ T细胞检测到的克隆型(unique TCRs)显著降低(图4D)。这说明PD-1-HI人群中检测到更多重复序列，提示克隆扩增。与此观察相一致的是，PD- 1-HI中扩张的克隆亚型在整个TCR库中所占的比例明显高于PD- 1-NEG CD8+ T细胞 (图4E)。

图4. TNBC化疗后CD8+ PD-1-HI外周血T细胞免疫功能增强

5.PD-1-HI CD8+ T细胞的单细胞RNAseq分析识别特异性细胞溶解标志物

接着，研究者使用两名TNBC患者（一名有残留病灶，Pt. 4；一名发生转移，Pt. 1）NAC后外周血中PD-1-HI CD8+ T细胞群进行单细胞分析。基于UMAP对细胞进行分类（图5A-B），在不同类别中表达差异最大的10个基因图5C所示，cluster 0在Pt. 4中被特异性的富集到。在cluster0特异性高表达的基因主要有高细胞毒性的记忆T细胞基因，MHC-I/II，溶细胞和免疫检查点相关基因（图5C-D）。

为更深入了解在cluster0中特异性表达的基因，研究者对两名TNBC患者NAC后外周血单细胞进行RNA测序，利用UMAP进行降维，SingleR对细胞类型进行注释（图5E）。在之前研究中识别到的8个基因在CD8+ T细胞和自然杀伤细胞中表达最高(图5E-F)。

图5. 2例TNBC患者NAC后CD8+ PD-1-HI外周血T细胞的单细胞RNA测序显示细胞溶解标志物的高表达

6.细胞溶解特征基因表达与复发风险增加

基于Kruskal-Wallis检验对不同复发风险状态下8个特征基因表达进行比较，研究者发现大部分基因和联合基因得分在早期复发样本中高表达，说明细胞溶解特征基因表达与复发风险增加相关（图6A-C）。

图6. 细胞溶解特征基因表达与复发风险增加

本篇文章主要是对新辅助化疗前后乳腺癌患者肿瘤免疫浸润程度的改变以及与患者预后之间的关系进行研究，包括免疫相关基因表达，不同免疫细胞浸润状态等，并通过单细胞分析进一步识别出特异性细胞溶解标志物，细胞溶解标志物的高表达和复发风险增加有关。这篇文章具有比较高的临床转化意义，基础研究很重要，把研究成果转化成具有临床价值的标志物也同等重要，小伙伴们在做研究时也要思考如何把实验成果进行转化哦。今天的内容就是这些，我们下次再见啦~