质粒DNA提取常见问题整理

一.时间控制问题

裂解时间太长，加入溶液P2后裂解时间不应超过5 分钟；吸附时间不够；溶解时间不够都会导致质粒DNA提取实验失败。

二.大肠杆菌老化

建议涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。

三.质粒拷贝数低

由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA 提取量低，可更换具体相同功能的高拷贝数载体。

四.溶液使用不当

溶液P2、P3 在温度较低时可能出现浑浊，应置于37℃保温片刻直至溶解为清亮的溶液，才能使用。

五.吸附柱过载

不同产品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的质粒量很大，请分多次提取。若用富集培养基，例如TB 或者 ×YT 菌液体积必须减少；若质粒或宿主菌是非常高的拷贝数或生长率，则需调整LB 培养液体积。

六.质粒未全部溶解

洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。

七.乙醇残留

漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体，树脂型试剂盒漂洗后应晾干树脂，再加入洗脱缓冲液。

八.洗脱液加入位置不正确

洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面达到最大洗脱效率。

九.洗脱液不合适

DNA 只在低盐溶液中才能被洗脱。洗脱效率取决于pH 值。最大洗脱效率在pH7.0～ 8.5 间。当用水洗脱时确保其 pH 值在此范围内，如果pH 过低可能性导致洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加暖至 60 ℃后使用有利于提高洗脱效率。

十.洗脱体积太小

洗脱体积对来回收率有一定影响。随着洗脱体积的增大回收率增高，但产品浓度降低。为了得到较高的回收率可以增大洗脱体积。