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前言
今天和大家分享的是2020年12月份发表在Molecular Therapy杂志上的一篇文章(IF=7.031)"Single-cell RNA-seq dissects the intratumoral heterogeneity of triple negative breast cancer based on gene regulatory networks"。文章中作者基于scRNA-seq数据并对TNBC患者上皮细胞进行分型，构建基因调控机制网络得到关键基因ETV6，并进行关键基因功能分析。
Single-cell RNA-seq dissects the intratumoral heterogeneity of triple negative breast cancer based on gene regulatory networks
基于单细胞RNA-seq构建基因调控网络分析三阴性乳腺癌异质性
一、研究背景
乳腺癌是女性最常见的肿瘤之一，通常伴有较高的瘤内异质性。传统上，乳腺癌患者根据ER(雌激素受体)、PR 40(孕激素受体)和HER2(人表皮生长因子受体-2)状态的免疫组化特征，可分为luminal A型、luminal B型、HER2+型和basal-like型。4个亚型的病理特征和预后结果有很大差异。大多数基底样乳腺癌表现为三阴性表型。与其他亚型相比，三阴性乳腺癌(TNBC)总是具有更高的转移概率和较差的预后。已有研究表明乳腺癌肿瘤内异质性是导致肿瘤耐药的主要原因，基于65个scRNA-seq数据的TNBC网络分析可以帮助我们剖析在肿瘤发生过程中起关键作用的风险基因。
二、研究思路
三、结果解读
1 TNBC患者的内在分子亚型
利用基因表达谱和基因组信息推断scRNA-seq数据中868个上皮细胞的CNVs，然后利用推断的CNVs将上皮细胞聚为3个不同的亚群。发现亚群1和亚群3的CNV数量较多，分别由134和411个细胞构成，因此推测这两个集群可能是恶性细胞。亚群2中的细胞CNV数量较少，由323个细胞组成(图1A和1B)，可能为非恶性细胞。接下来使用tSNE (t-Distributed random Neighbor Embedding)进行降维。结果显示上皮细胞被很好地分成四个不同的亚群(图1C)，这证实了层次聚类的结果。
图1.TNBC患者的细胞分型
使用PAM450模型将恶性上皮细胞分为5个分子亚型，分别为Normal-like、Basal-like、Her2+、LumA和LumB（在图1D）。发现6例患者的亚型组成具有很大的多样性。PT039和PT081由相当高的基底层样亚型细胞组成。检查患者的临床资料患者发现PT039和PT081显示出相对较大的肿瘤大小(图1E)，这表明基底样亚型的高成分可能与乳腺癌患者的进展有关。
为了研究TNBC肿瘤微环境中的细胞-细胞相互作用网络，使用python CellPhoneDB包分析不同细胞类型中配体-受体相互作用。p < 0.05的配体-受体对103被认为在两种细胞类型中具有显著的相互作用。发现巨噬细胞在细胞-细胞通讯网络中起主导作用(图2A)，这揭示了巨噬细胞在肿瘤微环境中的重要作用。在基底样乳腺癌细胞系中，自分泌信号AREG的调节被证实有助于巨噬细胞的募集。然后对5个分子亚型进行了基因集变异分析(GSVA)，鉴定50个HALLMARK基因集中的细胞活性。发现这5个分子亚型具有很大的多样性(图2B)，揭示了不同分子亚型在肿瘤内的异质性。
图2.细胞间相互作用网络和GSVA分析
2 基因调控网络
基于基因表达谱和tf结合基序信息构建正常上皮细胞和5个分子亚型特异性GRNs。首先，计算显著共表达的tf -基因对。其次，将显著富集tf结合基序的靶基因保留下来，以供进一步研究。最后，富集评分(ES) > 1被认为是构建GRN的显著TF-target 对(表1)。
表1.6个GRNs的TF-target数量
构建的GRNs发现个正常上皮细胞和5个分子亚型GRNs均近似符合幂律分布，表明这6个GRN存在高度连接的核心节点。发现在每个亚型特异性GRNs中，TFs的程度都有很大的差异。此外，在5个分子亚型特异性GRNs中没有任何规则(TF-target)保守，但在5个GRNs中有10个保守调控因子(TFs)。提出这些保守的TFs在不同的分子亚型中发挥不同的作用，可能与肿瘤内的异质性有关。
图3.5个分子亚型特异性GRNs
作者评估了6个GRNs中的关键基因：首先，作者使用中心指标评估基因的重要度。中心指标包括点度中心性（degree）、中介中心性（betweenness）、接近中心性（closeness）、特征值（eigenvalue）和pageRank。然后将Q值排名前1%的基因定义为关键基因，接下来从cancer Gene Census获得已知的癌症基因来评估这些关键基因是否在癌症基因中富集。发现分子亚型特异性GRN中的关键基因在已知的肿瘤基因中显著富集每个亚型中涉及已知癌症基因的关键基因显示了巨大的多样性。作者发现MYC表达升高被证实与乳腺癌患者的不良预后相关。致癌基因ELK4是亚型特异性网络中的另一个关键基因：Mesquita等发现ELK4拷贝数增加与肿瘤相关。每个亚型中关键节点的多样性从网络角度阐明了瘤內异质性。
3 关键基因功能的多样性
为了研究5个分子亚型中关键基因的功能发现ETV 6在5个分子亚型特异性GRN中普遍激活，而不是在正常上皮细胞GRN中激活(图3B-F)。推测ETV 6可能在5个分子亚型中发挥重要作用。然后重点研究了ETV6的功能多样性发现，ETV 6在不同亚型中调控不同的基因。在每个亚型中都有几个亚型特异性基因，这可能与乳腺癌的肿瘤内异质性有关(图4A)。此外，ETV 6在基底样亚型特异性GRNs中显示最高，这可能是基底样亚型的恶性特征。接下来，采用GO 富集分析评估了ETV 6在亚型中调控的基因的功能发现，ETV 6调控的基因在不同亚型中发挥着不同的作用，显示出高水平的肿瘤内异质性(图4B)。基底样亚型在血管发生生物过程中被特异性注释，这是由于基底样亚型中ETV 6对SGPL1的特异性调节。Engel等发现SGPL 1在乳腺癌中的表达可能是预后标志物，并作为乳腺癌治疗的潜在药物靶点。
图4.关键基因功能的多样性分析
然后，作者研究了ETV6在不同亚型中的表达水平。ETV 6在5个分子亚型中Basal-like患者的ETV6的表达量显著上调。TCGA基底样患者和正常乳腺标本中检测了ETV6的表达，与正常对照相比，基底样患者的ETV 6显著上调(图4D)。因此推测ETV 6的激活可能与TNBC患者的生存有关，而基于代谢数据发现ETV 6高表达患者的临床结局也相对较差(图4E) 。因此ETV6在5个分子亚型中的激活可能通过调节不同基因引起肿瘤内异质性，失调的ETV 6可能成为肿瘤治疗的一个潜在靶点。
四、小结
在本研究中作者使用scRNA-seq数据分析CNV并鉴定出545个恶性细胞，利用PAM50模型对恶性细胞的亚型进行分类，配体-受体相互作用分析揭示了巨噬细胞在肿瘤微环境中的重要作用。转录因子(TF)-基因对共表达并富集转录，构建基因调控网络并鉴定关键基因发现ETV6在乳腺癌的五种分子亚型中普遍被激活上调，失调的ETV6可调节各亚型的不同基因。作者使用TNBC患者的单细胞转录组数据构建了基因调控网络并从中鉴定到了关键基因。
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