冰冻切片的原理和基本步骤

冰冻切片是一种在低温条件下使组织快速冷冻到一定的硬度，然后进行切片的一种方法。制作过程较石蜡切片快捷、简便，因而多应用于手术中的快速病理诊断。

冰冻切片

1.取材：

应尽可能快地采取新鲜的材料，防止组织发生死后变化。

2.速冻：

1）将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约2cm）。

2）如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内。

3）当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。

4）在制成冻块后，即可置入恒冷箱切片机冰冻切片。

5）若需要保存，应快速以铝箔或塑料薄膜封包，立即置入-80℃冰箱贮存备用。

3.固定：

1）样品托上涂一层OCT包埋胶，将速冻组织置于其上，4℃冰箱预冷5-10min让OCT胶浸透组织。

2）取下组织置于锡箔或者玻片上，样品托速冻。

3）组织置于样品托上，其上再添一层OCT胶，以完全覆盖为宜，速冻架（PE）上30min。

4.切片：

1）恒温冰冻切片机为较理想的冰冻切片机，其基本结构是将切片机置于低温密闭室内，故切片时不受外界温度和环境影响，可连续切薄片至5-10μm。

2）切片时，低温室内温度以-15℃ ~ -20℃为宜，温度过低组织易破碎，抗卷板的位置及角度要适当，载玻片附贴组织切片，切勿上下移动。

5.免疫荧光染色：

1）冰冻切片室温晾干15min，可用含10%正常山羊血清的PBS室温封闭切片1小时（此步可不洗）。

2）滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液（抗体的量视组织大小而定，原则是可以均匀覆盖组织面，且保证整个过程中不会使组织干涸）。

3）将切片放在加了PBS的免疫组化湿盒，室温孵育2小时或4℃过夜。

4）第二天先将湿盒放到37℃回温1h，然后吸取片上的一抗进行回收，将切片插入到小染缸PBS冲洗。

5）滴加用PBS稀释好的二抗（避光）置于分子杂交箱中37℃孵育1小时。回收二抗，切片置于染缸内，PBS洗5min×3次。

6）滴加DAPI工作液染核，室温10-20min（工作浓度0.1%染色15min）。

7）回收DAPI，滴加5-10μl抗荧光衰减封片剂或中性树胶，用处理干净的盖玻片封片，即可到荧光显微镜或者共聚焦显微镜下观察拍照。

8）做好的切片放在切片盒内，置于4℃冰箱，可保存一周左右。