【LorMe周刊】噬菌体基因多样性可能是细菌进化的驱动力 / 四六文摘

作者：李婷婷，南京农业大学硕士在读，主要研究根际噬菌体疗法。

周刊主要展示LorMe团队成员优秀周报，每周定期为您奉上学术盛宴！本期周刊为您介绍噬菌体基因多样性对于宿主细菌的进化驱动性。原文于2020年发表于The ISME Journal。

摘要

CRISPR-Cas免疫系统广泛存在于细菌和古菌中，它通过在宿主基因组中的CRISPR基因座上插入噬菌体衍生序列以形成相关特异性序列，从而防止噬菌体的重感染。在实验室条件下，铜绿假单胞菌能够基于CRISPR免疫系统进化出对噬菌体DMS3vir的高水平抗性，从而导致噬菌体快速消亡。但是，自然条件下的噬菌体种群可能具有更高的基因多样性，理论上这可能会影响基于CRISPR免疫系统的进化频率，进而改变噬菌体的存在时长。对此本研究中作者利用试验进行了验证，在抵御更高基因多样性的噬菌体时，只有小部分细菌进化出基于CRISPR的免疫抗性，大多数细菌为阻止噬菌体吸附选择了SM（surface modification 即受体表面修饰系统）系统而进行表面修饰。但是那些基于CRISPR免疫抗性的细菌为了响应更高基因多样性噬菌体的侵染，也会获得更多的CRISPR记忆序列，旨在抵御更广基因型的噬菌体。尽管细菌的抗性进化存在差异，但在单基因型和多基因型噬菌体侵染两种处理中，噬菌体的衰减速率却相似，这表明本研究中基于CRISPR或SM的抗性的选择在该过程的生态动力学中起的作用相对较小。总体而言，本研究有助于我们了解基于CRISPR免疫抗性的驱动因素，从更广泛的的角度来看，在细菌-噬菌体共进化中，细菌进化出广谱防御比进化出特异性防御更普遍。

细菌针对不同噬菌体的抗性策略不同

细菌对于噬菌体的抗性免疫系统多种多样，但是启动抗性系统是需要生存成本的，所以当噬菌体侵染力较弱的时，细菌会倾向于选择成本更低的CRISPR系统；当噬菌体侵染能力较强的时，成本较高SM系统则比较受青睐。

基于CRISPR免疫序列是特异性抗噬菌体侵染的，作者假设细菌面对基因多样性的噬菌体侵染时会倾向于选择成本更高的SM系统，这样一来成本更低的CRISPR免疫抗性的进化就会受到相应的限制，这也会间接引起影响噬菌体存在时长等连锁反应。为测试这一点，作者以铜绿假单胞菌PA14突变株扩繁DMS3vir，传代17次来增加噬菌体多样性。对噬菌体进行深度测序，分析相对于来自单一的对照种群，多样化的噬菌体种群的基因多样性是否增加（如SNP频率，即单核苷酸多态性）。基于此分析，发现多样化噬菌体种群的平均值为9.2，而单一种群的平均SNP数仅为3。当然因为稀有等位基因被滤除以限制测序错误产生的误差，利用深度测序分析SNP频率时，不可避免地低估了基因变异的真实水平。利用Kruskal–Wallis检测证实，多样化噬菌体群体的平均SNP频率高于配对单一种群的对照组（图1A），这表明相对于单一噬菌体而言，基因多样化的噬菌体会激发细菌免疫系统更多的响应。

图1 单一噬菌体与多样化噬菌体的SNPs测试

紫色是基因多样化的噬菌体，蓝色是单一的噬菌体（采用克隆方式获取以避免个体差异带来的误差）

基因多样化的噬菌体对基于CRISPR系统的细菌侵染性更强

噬菌体侵染宿主的时候经常会遇到宿主通过修饰表面受体来防止侵染，但也有噬菌体能够绕过CRISPR系统成功侵染，作者假设与对照的单一噬菌体群体相比，基因多样化的噬菌体对具有基于CRISPR免疫力的细菌的侵染性更强，所以进行了第二步关于噬菌体多样性与宿主免疫系统的试验。

作者分析了基因多样化组和单一组两个处理组的噬菌体对于宿主的侵染力水平以评估基因多样性和免疫系统抗性的博弈。通过研究铜绿假单胞菌PA14的基于CRISPR免疫的12个单一的种群，以及具有基于SM抗性的PA14菌株和WT菌群对于噬菌体的不同反应来看，噬菌体滴度随时间的变化没有明显差异（图2A）。而免疫系统的响应则不同：相比于单一噬菌体而言，基因型多样化的噬菌体可以部分绕过CRISPR系统且大大增加更高成本的SM系统的响应（图2B）。这正如预期的那样，增加噬菌体的基因多样性会导致宿主细菌基于CRISPR免疫进化的频率降低，而基于SM抗性进化的频率相应增加。

图2 噬菌体基因多样性对噬菌体持久性无影响

噬菌体的多样性促进宿主细菌的抗性进化

通过前面的试验我们知道了基因多样化的噬菌体会激发宿主更多的免疫响应，同时更高的基因多样性对噬菌体而言也意味着侵染成功率的增加。那么，宿主细菌如何应对基因多样化的噬菌体呢？作者在这里进行了第三步的试验。

通过PCR分析来分析单一噬菌体和基因多样化噬菌体对于宿主的免疫基因变化，这里需要介绍的是，CRISPR系统是一种在噬菌体入侵会在宿主的CRISPR基因座上插入此次入侵噬菌体记忆信息的特殊序列的免疫系统。所以检测CRISPR插入位点的变化能够反应宿主对于噬菌体入侵的免疫变化。如图3能够明显看出对于基因多样化的噬菌体而言宿主的插入位点是明显增加的，同时更多的插入位点也显示出对噬菌体更高的抗性。

图3 噬菌体基因多样性与宿主获得嵌入序列数量的关系

总结

文章从CRISPR这一常见的宿主免疫系统和噬菌体基因多样性的互动入手，一步步向我们展示了噬菌体多样性对于宿主免疫系统的激发。宿主也像人一样在抵御外敌的时候对于抵御成本精打细算，因此免疫系统的响应是具有规律性的。同时，作者巧妙地通过CRISPR-Cas的插入位点来证明当噬菌体更加多样化时，宿主也会更加多样化。这些有助于我们进一步了解微生物种群中的CRISPR-Cas适应性免疫系统的进化，并补充了以前噬菌体基因多样性对细菌多样性的驱动作用。