【综述】欧洲垂体病理学组关于垂体神经内分泌肿瘤标准化诊断方法的建议
《Virchows Archiv:an international journal of pathology 》杂志 2019年 10月2日在线发表法国、意大利、英国、罗马尼亚、俄罗斯、匈牙利、德国、捷克等国的Villa C , Vasiljevic A , Jaffrain-Rea ML 等二十五位作者联合撰写的综述《垂体神经内分泌肿瘤（PitNETs）的标准化诊断方法:欧洲垂体病理学组(EPPG)的建议。A standardised diagnostic approach to pituitary neuroendocrine tumours (PitNETs): a European Pituitary Pathology Group (EPPG) proposal.》( doi: 10.1007/s00428-019-02655-0)。
2017年世界卫生组织(WHO)的分类建议根据原发腺垂体肿瘤的细胞谱系来进行分型（type）和分亚型(subtype)，目的旨在建立更加一致的肿瘤归类。不典型腺瘤的定义被去除，以支持高风险腺瘤，并建议评估增殖活性（proliferative activity）和侵袭性（invasion），以诊断进袭性（aggressive）肿瘤。最近，国际垂体病理学团体（the International Pituitary Pathology Club ）提出将腺瘤改称为垂体神经内分泌瘤(PitNET)，以更好地反映腺垂体与其他器官的神经内分泌肿瘤的相似性。欧洲垂体病理学组(EPPG)认可这一术语，并为组织病理学家和神经病理学家给出关于垂体神经内分泌瘤(PitNET)的标准化报告的实用性建议。这篇简短的报告介绍了欧洲垂体病理学组(EPPG)关于报告垂体神经内分泌瘤(PitNET)的共识的结果，并提出了一个诊断方式。2017年世界卫生组织(EHO)分类根据病理标准以鞍区神经内分泌和非神经内分泌肿瘤的分型及亚型为基础，并建议应用受谱系限制垂体转录因子(TFs)用于诊断实践。新的实体被引入，术语“不典型腺瘤”被去除，而一些肿瘤类型和亚型现在被认为具有固有的进袭性（intrinsically aggressive）。一群对鞍区病理学有兴趣和专业知识的欧洲病理学家、内分泌学家和科学家在2016年成立欧洲垂体病理学组(EPPG)。欧洲垂体病理学组(EPPG)最近得到了欧洲神经内分泌协会的支持(https://www.eneassoc.org)。欧洲垂体病理学组(EPPG)的目标是(i)对具有挑战性的病例提供合议评论；(ii)提出标准化报告以及改进诊断实践的诊断方式；(iii)标准化的免疫组化(IHC)方案；(iv)完善鞍区肿瘤的预后和预测指标;(v)在年轻病理学家中推广这一学科。在这份简短的报告中，我们提出了一个标准化的格式(图1)和诊断方式(图2)作为在儿童和成人中诊断垂体神经内分泌肿瘤的实用工具。未来的欧洲垂体病理学组(EPPG)活动将更加集中在罕见的垂体神经内分泌肿瘤、免疫组化标准化、进袭性的标志物、和治疗反应方面，以及对鞍区非神经内分泌肿瘤的标准化报告。
图1 .欧洲垂体病理学组(EPPG）关于垂体神经内分泌肿瘤（PitNETs）组织学报告标准化的提案
图2 .欧洲垂体病理学组(EPPG）的垂体神经内分泌肿瘤（PitNETs）的诊断方式。所使用的缩写：GH,生长激素； LMWK，低分子量细胞角蛋白； FB，纤维小体；SG，稀疏颗粒性；DG，致密颗粒性；PRL，泌乳素； TSH ，促甲状腺激素； PIT1，垂体特异性阳性转录因子1； ACTH，促肾上腺皮质激素；FSH ，卵泡刺激素； LH ，促黄体生成素；TPIT T-box 转录因子； TF，转录因子； SF1，类固醇生成因子1。从腺瘤到垂体神经内分泌肿瘤欧洲垂体病理学组(EPPG)赞同国际垂体病理学团体在2016年达成的共识用垂体神经内分泌肿瘤（PitNET）取代腺瘤这个术语,如同最近WHO的神经内分泌肿瘤（NEN）专家组所建议的，以使垂体神经内分泌肿瘤（PitNETs）与其他神经内分泌肿瘤(NEN)相匹配。提出标准化的组织学报告为了安全、准确地诊断垂体神经内分泌肿瘤（PitNETs），欧洲垂体病理学组（EPPG）推荐了一种多步骤的方法(图1)，包括临床和神经影像学特征的总结、激素的免疫组化（IHC）和转录因子（TFs）、增殖性的评估，以及在有指证时使用标志物预测治疗反应。我们强调，评估鞍区病理学需要经过充分的培训，以及涉及内分泌学家、神经放射学家、神经外科专家、遗传学家和肿瘤学家的综合性、多学科的手段。步骤1:临床和神经影像学特征应被整合纳入病理报告。欧洲垂体病理学组（EPPG）建议内分泌状态、术前药物治疗和复发应在病理报告中得到总结(图1-1.1)。特别是对于30岁以下患者，应检查家族史和遗传综合征。还应记录肿瘤大小和周围结构受侵袭情况(图1-1.2)。虽然我们承认，解释临床和神经影像学特征并不是病理学家的职责范围，但这些信息与临床静脉性(silent)肿瘤的结论性诊断相关联，而且与确认根据欧洲内分泌学会指南(European Society of Endocrinology guidelines)所定义的进袭性垂体神经内分泌肿瘤（aggressive PitNETs）相关。步骤2:定义类型和亚型苏木精-伊红(H&E)染色切片提供了架构（architecture）、细胞结构（cellularity）和细胞学特征(cytological features)，如嗜酸性细胞变化（oncocytic change）、坏死和炎症，的基本概述。应记录正常垂体前叶和垂体后叶的情况(图1- 3.1)。对于库欣病(CD)患者，建议用网织蛋白染色（reticulin staining）或胶原蛋白(collagen)IV免疫组化来描述垂体神经内分泌肿瘤(PITNETs），和残留的垂体前叶腺体(图1-3.2和图2-2.2）。与目前的WHO分类相一致，我们建议对垂体激素进行全面的（full panel）的没有组化（IHC）分析(图1-4)。垂体神经内分泌肿瘤（PitNET）分型和亚型应以垂体激素的模式（the pattern of pituitary hormones）来定义，并且表达为阳性细胞的近似百分比（approximate percentages of positive cells）(图1-4和图2)。激素情况（The hormonal profile）对于临床治疗处理仍然至关重要。低分子量细胞角蛋白免疫组化(IHC for low molecular weight cytokeratin，LMWK)应该用来细化某些垂体神经内分泌肿瘤的分型和亚型诊断。（静默性或库欣病）促肾上腺皮质激素细胞垂体神经内分泌肿瘤有表达一致的强烈的细胞质低分子量细胞角蛋白免疫组化与促肾上腺皮质激素(沉默或CD)（Intense cytoplasmic LMWK expression is consistent with corticotroph PitNET），核周模式显示浓密的颗粒性生长激素细胞和丰富的(> 70%)“纤维小体”的特点是稀疏颗粒性生长激素细胞垂体神经内分泌肿瘤变体的特点（perinuclear pattern suggests densely granulated somatotroph and abundant(> 70%) “fibrous bodies” are characteristic of the sparsely granulated variant of somatotroph PitNETs）(图1-4和图2-2.1、2.2、2.4)。促性腺激素垂体神经内分泌肿瘤通常会出现为LMWK表达有限甚至缺失（Gonadotroph PitNETs usually show limited or even absent LMWK expression）。也应报告正常促肾上腺皮质激素细胞的Crooke玻璃样变，因其证实皮质醇增多症（Crooke’s hyaline changes in normal corticotrophs should also be reported as they confirm hypercortisolism）。转录因子（TFs）很有用，但是仍然需要诊断性验证（diagnostic validation）。基于转录因子（TFs）的评估可能会产生误导。McDonald等人提出的方式(algorithm)应使用新获得的抗TPITt和PIT1抗体进行重新测试，并结合MIB1/Ki67整合评估（be retested with newly available anti-TPIT and PIT1 antibodies and integrated with MIB1/Ki67 assessment）。硬脑膜（dura mater）、骨质（bone）或呼吸系统道粘膜（respiratory mucosa）的微观的侵袭性（Microscopic invasion）并不是经过确认的进袭性标志（validated markers of aggressiveness），但有助于反映肿瘤的侵袭性(map tumour invasion)(图1-3.4),且和术前磁共振成像(MRI)和外科医生的术中观察相关。电子显微镜对诊断分型或亚型不太可能添加任何相关信息（Electron microscopy is unlikely to add any relevant information to the diagnosis of type or subtype）。在需要时,标本可以从石蜡块中再加工(When required,samples can be reprocessed from paraffin)。步骤3:评估有丝分裂活性和增殖性与其他神经内分泌肿瘤（NETs）相似，必须仔细评估使用MIB1/Ki67免疫组化（IHC）的有丝分裂计数和增殖性。有丝分裂应按每平方毫米计数(由于显微镜不同，5个视野×40相等于1平方毫米)(图1 - 3.3)。MIB1 / Ki67标记指数应在两个热点中测量，且所有标记的肿瘤细胞无论强度如何都应被计数。必须回避淋巴细胞，内皮细胞和基质细胞(图1-4)。核阳性的数量应以肿瘤细胞总数的百分数(指数)表示。我们建议每个热点在500到1000个肿瘤细胞之间进行计数。目前的截断值是≥3%，被认为与预后相关。MIB1 / Ki67超过10%需要进一步调查，以排除转移灶沉积（metastatic deposit），或罕见的非内分泌的原发性鞍区黑色素细胞或间质细胞谱系的肿瘤（melanocytic or mesenchymal lineage）(图1 - 4)。步骤4:对垂体激素阴性的肿瘤的评估和零细胞垂体神经内分泌肿瘤的诊断根据欧洲垂体病理学组（EPPG）成员的经历，约占15-20%的垂体神经内分泌肿瘤，由于其表现为有限的或缺乏表达(图2-2.4)或有垂体激素的异常组合(例如ACTH-GH)，会具有挑战性。在激素阴性的情况下，神经内分泌来源应通过嗜铬粒蛋白（chromogranin）A和三种转录因子（TFs）的免疫组化(图1-4和图1和图2 - 2.1,2.4)来证实。特别是，转录因子（TFs）能帮助诊断促性腺激素细胞和促肾上腺皮质激素细胞垂体神经内分泌肿瘤，以及多激素PIT1阳性的垂体神经内分泌肿瘤（PitNET）等亚型(图2-2.4)。多激素PIT1阳性的垂体神经内分泌肿瘤(PitNETs包括)临床上静默性和功能性多激素肿瘤，伴有肢端肥大症和中枢性甲状腺功能亢进和/或高泌乳素血症。这个诊断的一个潜在危险（pitfall）在于，这些肿瘤的临床表现和演变可能有所不同。我们认为应该进一步研究静默性相比功能性多激素PIT1阳性垂体神经内分泌肿瘤的行为上的潜在差异。2017年WHO分类修订了“零细胞腺瘤(null cell adenoma)”的概念,并定义为没有垂体激素免疫组织化学证据的和转录因子(TFs)表达的肿瘤。根据这个定义，报告的“零细胞”垂体神经内分泌肿瘤的发生率下降到大约1%而之前认定的“零细胞”肿瘤表达SF1，可以分配到促性腺激素细胞谱系。我们强调在诊断为“零细胞”垂体神经内分泌肿瘤之前，排除其他原发性或转移性鞍区肿瘤的重要性。值得记住的是，正常的腺垂体细胞可以被类似多激素垂体神经内分泌肿瘤（PitNETs ）的非神经内分泌肿瘤所包埋(entrapped)。步骤5:定义进袭性垂体神经内分泌肿瘤2017年WHO不再推荐用“不典型(atypical)腺瘤”一词来定义具有潜在不良生物学行为的垂体神经内分泌肿瘤。与欧洲内分泌学会最近的指南同步，欧洲垂体病理学组（EPPG）对于进袭性垂体神经内分泌肿瘤提出完整的临床病理方法，包括通过术前MRI/内镜术中检查，连同MIB1/Ki67指数≥3%，和有丝分裂计数> 2/10HPF（高倍镜视野），定义侵袭性（invasive）。p53的表达没有被确认为进袭性行为（aggressive behavior）的独立标志物，但时常与高Ki67指数相关。Trouillas和同事的方法已经得到不同的研究的验证，因此可以引入诊断实践(图1-5)。根据WHO定义的分型和亚型可能没有预后的含义;例如，已经证实静默性促肾上腺皮质激素细胞垂体神经内分泌肿瘤具有潜在的进袭性。步骤6:指导治疗的标志物生长抑素受体(SSTs)状态可以预测使用第一代和第二代生长抑素类似物（SSA）进行治疗的反应。然而，内分泌学家对于系统评估组织中的生长抑素受体(SSTs)的潜在获益存在争议。因此，欧洲垂体病理学组（EPPG）建议可根据需要进行SST2和SST5的免疫组化（IHC）分析。在泌乳素肿瘤中的雌激素受体α的低表达(得分< 6)的预后价值需要确认。替莫唑胺(TMZ)目前被用于进袭性垂体神经内分泌肿瘤（PitNETs）患者。根据在神经胶质瘤中取得的经验，MGMT（甲基转移酶）蛋白的低表达被认为与对这种药物有更好的反应相关。然而，这种相关性在垂体神经内分泌肿瘤中并不强健（robust）；MGMT状态在进袭性垂体神经内分泌肿瘤的治疗中的预测价值，以及如何评估MGMT仍存在争议。建议的诊断方式（Proposed diagnostic algorithms）图2中提出的诊断方式是设计来指导病理学家进行安全准确的诊断。罕见的亚型，如泌乳素生长激素细胞(mammosomatotroph）和嗜酸干细胞（acidophil stem cell）垂体神经内分泌肿瘤（PitNRTs）不包括在内。按三个主要的垂体谱系:PIT1、TPIT和SF1，进行亚型归类(图2)。图2 - 2.4是为临床上的无功能性垂体神经内分泌肿瘤（clinically non-functioning PitNETs）设计的方式，排除了促性腺激素肿瘤（gonadotroph tumours）。其他建议与垂体卓越中心的指南（the guidelines for Pituitary Centres of Excellence）相一致，我们建议对组织碎片进行低温保存（cryopreservation of tissue fragments）以利于进一步调查及帮助研究。欧洲垂体病理学组关于垂体神经内分泌肿瘤组织学报告标准化的提案1.术前资料1.1内分泌状态术前治疗史肿瘤复发（是/否）1.2术前磁共振成像（有/无）最大直径(mm)正常大小/微腺瘤/大腺瘤/巨腺瘤侵袭性海绵窦（有/无/未知）蝶窦（有/无/未知）其他骨质（有/无/未知）2.宏观2.1固定的组织碎片数目（标注固定方式）冷冻的组织碎片数目图1 .欧洲垂体病理学组(EPPG）关于垂体神经内分泌肿瘤（PitNETs）组织学报告标准化的提案（）图1 .欧洲垂体病理学组(EPPG）关于垂体神经内分泌肿瘤（PitNETs）组织学报告标准化的提案（3部分)3.组织学3,1苏木精伊红染色(HE染色）腺垂体(是/否）神经垂体（是/否）其他特点嗜酸性改变/钙化/炎性/坏死/囊性/纤维化3.2库欣病如果肿瘤不明显，网织蛋白染色或胶原蛋白IVCrook 细胞（有/无）3.3有丝分裂计数每10高倍视野下(40X）的有丝分裂计数3.4组织学侵袭硬脑膜（有/无）骨质（有/无）呼吸道粘膜（有/无）图1 .欧洲垂体病理学组(EPPG）关于垂体神经内分泌肿瘤（PitNETs）组织学报告标准化的提案（4部分）4.免疫组化抗体的表现（注意参考克隆复制）●激素（%）PRL，GH,TSH, ACTH,FSH,LH●细胞角蛋白低分子量模式：纤维小体（>70%）(有/无)/细胞质（有/无）/阴性●增殖性标志物(在热点处的计数）MIB1/Ki67指数 （%）●转录因子PIT1(+/-),TPIT(+/-),SF1(+/-)●嗜铬粒蛋白A(CgA)(+/-)如有必要：●p53(如果MIB1/Ki67≧3%）：阴性/ _%●SSTRs（生长抑素受体）（评分）●ERα(雌激素受体α）（评分）图1 .欧洲垂体病理学组(EPPG）关于垂体神经内分泌肿瘤（PitNETs）组织学报告标准化的提案（5部分）5垂体神经内分泌肿瘤的诊断伴/不伴（有丝分裂计数和Ki67指数）增殖标志物的形态学分类1a;1b;2a;2b;3级的整合诊断○当有指证时，评估MGMT
图1中的附图免疫组织化学分析的多层次方式1级PRL/GH/TSHACTHFSH/LHLMWK(低分子量细胞角蛋白）#MIB1/Ki672级PIT1TPITSF1如果1级的结果为：-免疫阴性或稀疏阳性或为多激素或不常见的组合3级嗜铬粒蛋白A(CgA)*SSTRs(生长抑素受体）P53只对部分病例进行（见文中详述）#LMWK（低分子量细胞角蛋白）:针对促肾上腺皮质激素细胞肿瘤和生长激素细胞肿瘤*嗜铬粒蛋白A(CgA)*，在所有免疫阴性或稀疏阳性的肿瘤中必须进行分析图2，欧洲垂体病理学组的垂体神经内分泌肿瘤的诊断方式欧洲垂体病理学组的垂体神经内分泌肿瘤的诊断方式2.1 PIT1细胞谱系：生长激素-泌乳素-促甲状腺激素细胞垂体神经内分泌肿瘤分泌免疫表型诊断肢端肥大症，或巨人症+高泌乳素血症GH+GH+/-,LMWK ，纤维小体稀疏颗粒性生长激素细胞GH++,核周LMWK致密颗粒性生长激素细胞PRL+(>10%)和GH+混合性GH/PRL高泌乳素血症PRL+泌乳素细胞中枢性甲状腺功能亢进TSH+促甲状腺激素细胞TSH+,GH+和/或PRL+和PIT1+促甲状腺激素细胞多激素性PIT1+肢端肥大症，或巨人症+中枢性甲状腺功能亢进 +高泌乳素血症TSH+,GH+和/或PRL+和PIT1+生长激素细胞多激素性PIT1+2.2TPIT细胞谱系：促肾上腺皮质激素细胞垂体神经内分泌肿瘤库欣病ACTH+ACTH+/-LMWK+细胞质稀疏颗粒性促肾上腺皮质激素细胞ACTH+++LMWK+细胞质致密颗粒性促肾上腺皮质激素细胞ACTH+LMWK+环状Crooke细胞型建议用网织蛋白染色或胶原蛋白IV对微腺瘤进行诊断2.3 SF1 细胞谱系：促性腺激素细胞垂体神经内分泌肿瘤无功能性/高促性腺激素FSH+,LH+促性腺激素细胞2.4 无功能性垂体神经内分泌肿瘤免疫表型诊断ACTHACTH+++LMWK+细胞质静默性促肾上腺皮质激素细胞ACTH+/-LMWK+细胞质TPIT+静默性促肾上腺皮质激素细胞GH+和/或PRL+和/或TSH+PIT1+静默性PIT1+所有垂体激素阴性或异常阳性细胞SF1+促性腺激素细胞TPIT+静默性促肾上腺皮质激素细胞PIT1+静默性PIT1+所有的转录因子都为阴性零细胞或免疫阴性