易基因 - Mol Biol Evol：利用RRBS技术多维度分析人和小鼠的疾病表观遗传变化
关于RRBS
简化甲基化测序(Reduced Representation Bisulfite Sequencing,RRBS)是利用限制性内切酶对基因组进行酶切，富集启动子及CpG岛等重要的表观调控区域并进行重亚硫酸盐测序。该技术显著提高了高CpG区域的测序深度，在CpG岛、启动子区域和增强子元件区域可以获得高精度的分辨率，是一种准确、高效、经济的DNA甲基化研究方法，在大规模临床样本的研究中具有广泛的应用前景。
相对WGBS而言，RRBS技术是一种高性价比的甲基化测序方案，广泛适用于动物物种的甲基化研究，哺乳动物中以人为例，RRBS测序可以检测到高达12%（5M-6M）以上CpG位点。
通俗点说，与WGBS相比RRBS更实惠
WGBS更全面，各有优势
重点来了
今天为大家分享解读一项利用RRBS测序技术研究人类及小鼠的衰老和癌症表观遗传特征的外文文献，研究人员使用RRBS揭示来自人类和小鼠的年轻和年老、肿瘤和非肿瘤大脑样本的大脑表观特征差异。本文测序方法简单性价比高但超有效，研究思路和分析方法值得看看。
标题：Conservation of aging and cancer epigenetic signatures across human and mouse.
发表时间：2021/04/19
单位：西班牙奥维尔多大学
发布期刊：Mol Biol Evol
影响因子：IF 11.062
测序技术：RRBS
研究背景：
衰老和癌症是两个相互关联的过程，衰老是癌症发展的主要危险因素。此前有许多研究发现癌症和衰老DNA甲基化存在着一定差异。但是这些研究大多使用小鼠模型，缺乏系统的比较疾病背景下人类和小鼠的表观遗传模式，而这种比较可以确定某些观察到的物种特异性和表观遗传特征异同的关联程度。
研究摘要：
本文研究结果表明，在全基因组范围内，人类和小鼠两种物种在癌症和衰老中DNA甲基化水平变化特征存在显著差异。研究人员提出了人类和小鼠特定癌症和衰老表观基因组特征的有力证据，表观遗传特征的改变包括改变的位置、染色质背景、遗传通路和所涉及的转录因子（TF）。另外对人类和小鼠不同物种间的直系同源CpG区域的表观基因组数据分析，提示了人类和小鼠不同物种在癌症和衰老中DNA甲基化的常见CpG位点和变化水平差异。
研究思路：
在这项研究中，使用RRBS测序分析揭示了包括人类和小鼠的年轻与年老、肿瘤与非肿瘤脑组织样本的表观遗传特征。
（1）首先，研究人员分析人类和小鼠的基线表观基因组模式，重点关注与癌症和衰老相关的DNA甲基化水平变化，且对不同物种间DNA甲基化水平差异进行比较。
（2）随后，研究人员分析与DNA甲基化水平改变相关的表观基因组背景。
（3）接着，研究人员整合相关数据研究人类和小鼠不同物种间的直系同源CpG区域的DNA甲基化水平。
（4）最后，研究人员在基因组背景下揭示疾病和物种特异性的表观遗传特征。
研究结果：
1、人类和小鼠的DNA甲基化水平高低主要由CpG区域密度决定
研究人员入组24个样本研究人类和小鼠的年轻与年老、肿瘤与非肿瘤大脑组织样本的全基因组DNA甲基化模式（人类和小鼠各12，每组3个，图1A )，研究人员采用简化甲基化测序(RRBS)技术对两个物种CpG 岛的大部分CpG 位点（图1D）进行测序分析研究，结果发现在人和小鼠样本中具有类似的 CpG 位点，证实了在人类和小物种中，DNA甲基化水平高低主要由CpG位点的密度决定（图1H）。
研究人员将 CpG 位点分类为高、中或低甲基化位点进行对比（平均甲基化值分别为＞0.8、[0.2,0.8]和＜0.2），并对这些位点与组蛋白标记的共定位进行富集分析（FDR ＜0.05），在人和小鼠中观察到几乎相同的甲基化状态染色质特征（图1I）。高甲基化位点与基因体区的活性H3K36me3 和抑制性 H3K9me3 标记相关，中间甲基化位点与增强子/启动子相关的H3Kme1标记相关，低甲基化位点与活性启动子和增强子 H3K4me3 和H3K27ac 标记相关，证实了在人类和小鼠两个物种中的DNA甲基化水平和CpG区域密度的之间的密切关系。
图1
2、人类和小鼠癌症和衰老中DNA甲基化变化特征存在差异
人类样本
（1） 研究人员使用严格的阈值（FDR＜0.05，甲基化的平均变化＞0.2）对RRBS分析的位点进行DNA甲基化差异分析，共分析出154,770个与癌症相关的差异甲基化CpG（dmCpGs）和 66,838个与衰老相关的dmCpGs，其中高甲基化在癌症样本中占变化的 72%（图2C和D），且癌症高甲基化在CpG密集区域发生的频率更高。
（2） 将dmCpGs 映射到 CpG 岛位置时（图2E），发现癌症相关的高甲基化和低甲基化的深度和分布存在较大差异；而与衰老相关的甲基化水平改变都位于相似的位置，基本与癌症相关的低甲基化区域一致。
（3） 将分析出来的dmCpGs相交，观察所有过程中的共同CpG集（图2H，P＜0.001)，且对交叉点进行富集分析，发现癌症和衰老之中的DNA甲基化失调的存在一个共同特征——Polycomb靶向基因，区别在于Polycomb靶向基因在癌症中呈现高甲基化，而在衰老中呈现出高甲基化或低甲基化。（图2）
小鼠样本
（1） 与疾病相关的DNA 甲基化变化模式，尤其是癌症和衰老变化，基本与人类样本呈现相同趋势，但癌症中DNA甲基化水平增加趋势更明显（图3A）。
（2） 在做DNA甲基化差异化分析时（FDR ＜0.05，甲基化的平均变化＞0.2），则发现了较大差异，在癌症样本和衰老样本中分别分析出181,027和22,564个dmCpGs，超甲基化是最主要的现象，其中癌症样本中超甲基化率68%，衰老样本超甲基化率62%（图3C和D），dmCpGs的分布位置分布与人类样本相似（图 3E）。
（3） 将分析出来的dmCpGs相交，观察所有过程中的共同CpG集（图3H，P＜0.001)，且对交叉点进行富集分析，并未发现癌症和衰老两种疾病之中存在共性，即Polycomb靶向基因在癌症中呈现高甲基化，但在衰老中的表现并不明显。（图3）
可以得出结论：人类和小鼠癌症和衰老中DNA甲基化变化特征存在差异。
图2(左) 图3（右）
3、物种特异性在癌症和衰老 DNA 甲基化改变的差异与染色质有关
鉴于观察到人类和小鼠之间DNA甲基化变化的差异性，研究人员将所有甲基化数据与相关组蛋白修饰数据（包括组蛋白修饰 H3K4me1、H3K4me3、H3K27ac、H3K36me3、H3K27me3 和 H3K9me3）进行整合和差异化分析，研究不同组蛋白修饰的两个物种中癌症和衰老相关dmCpGs的关联，发现不管是在人类还是小鼠中，癌症和衰老的DNA甲基化水平变化都受到染色质状态的影响。
其中，组蛋白修饰结果揭示了人类和小鼠两种物种种与癌症和衰老相关的DNA甲基化变化存在相似性。
而研究人员对dmCpGs位点相关的转录因子（TF）进行HOMER分析，发现了不同物种间疾病过程中的异同：癌症高甲基化dmCpGs与两个物种的Homeobox TFs相关（Fisher's P＜0.001，ORs = 人和小鼠均2.7）；而癌症低甲基化dmCpGs在人类的 bHLH 和 HMG 区域的TFs特别丰富（Fisher's P＜0.001，ORs =人11.4和小鼠8.8）；在衰老场景中，高甲基化特别影响ETS区域的TFs位点（Fisher's P＜0.001，ORs=人48.5和小鼠26.9，），而低甲基化涉及 bHLH 和 HMG 区域的TF 位点（Fisher's P＜0.001，ORs =人bHLH 6.9、人HMG 12.0 和小鼠bHLH 7.8 、小鼠HMG 16.6）。表明在衰老场景中，人和小鼠两个物种在TFs位点的DNA甲基化变化存在明显的差异（图4）。
但无论如何变化，疾病和物种特异性的表观遗传特征都受到所涉及的特定 CpG位点周围的基因组背景的影响。（图5）
图4
图5
人类和小鼠两种物种在癌症和衰老DNA甲基化改变研究结果说明
（1）研究设计中使用的样本量虽然有限（n=24）,但两种物种研究结果证明观察到的结果是稳健的。
（2）虽然在设计中只分析了大脑组织，但癌症和衰老中出现的表观遗传特征改变在不同组织中是相似的。
（3）使用RRBS技术分析人类和小鼠的表观调控区域，在所有样本中具有足够的覆盖范围，能够定义大的种间测量子集（59,100 个 CpG 位点）。
易基因小结
研究目的：
研究人类和小鼠物种在癌症和衰老中DNA甲基化变化特征
研究结果：
1、人类和小鼠的DNA甲基化水平高低主要由CpG区域密度决定
2、人类和小鼠癌症和衰老中DNA甲基化变化特征存在差异
3、物种特异性在癌症和衰老 DNA 甲基化改变的差异与转录因子有关
4、疾病和物种特异性的表观遗传特征与CpG位点相关
易基因点评：
从临床的角度来说，这项研究结果的成果出炉可以为定制测序平台的设计和开发铺平道路，广泛适用于哺乳动物的甲基化测序技术RRBS可以富集启动子及CpG岛等重要的表观调控区域并进行重亚硫酸盐测序。从多组学角度系统评估跨物种和组织的疾病相关表观遗传模式，可以促进识别动物模型中的药物敏感通路和表观遗传药物筛选，预测人类疾病未来的成功治疗方式，或许可以推进相关治疗药物研发。
文献来源：doi.org/10.1093/molbev/msab112
可通过扫码获取文献原文