农杆菌感受态制备和转化：电转法和热击法

电转法

1） 挑取新鲜单菌落接种到10mL  YEP培养基（含50ug/ mL利福平）的试管里，28℃、200r/min培养过夜。

2） 稀释2 mL培养过夜的农杆菌到含200 mL YEP培养基的500 mL三角瓶里， 28℃、200r/min培养至OD600达0.5。4℃、5000 r/min离心5分钟收集细胞。

3） 用适量体积的 10%的甘油（用去离子水配置）重悬洗涤沉淀2次，洗涤时一定要轻柔地把细胞悬均匀，每次4℃、5000 r/min离心5分钟收集细胞，小心将上清倒掉。

4） 将细胞重悬于1 mL 10%的甘油里，细胞可以立即使用，也可分装成每管40μL（质粒连接产物体积不能超过感受态细胞体积的1/10，否则容易爆杯），经液氮速冻后，-70℃冰箱保存备用。

5） 取一管感受态细胞放在冰上融化，加入100ng DNA样品混匀，将样品放入冰上的电击杯中，按照电击仪厂商说明进行电击转化，之后涂布在含有相应抗生素的YEB平板上培养（质粒抗性+农杆菌菌株抗性）。

热击法

1） 挑单菌落于2 mL YEP培养基（含Rif 50mg/ mL）中28℃过夜活化；
2） 取2 mL过夜菌液接种于200 mL YEP培养基中28℃振荡培养生长至OD600约等于0.5左右；
3） 冰上放置30 min左右，5000 rpm离心5 min；
4） 在60 mL冰水浴预冷的无菌0.1M CaCl2溶液中中悬浮细胞；
5） 5000 rpm离心5 min，悬浮细胞加入20 mL冰水浴预冷的含15%甘油的0.1M CaCl2，轻敲管壁使菌体悬浮均匀，每管200 µL进行分装，液氮速冻后保存于-80℃待用；
6）  取200 µL 感受态细胞，加入0.5 µg 质粒DNA，液氮中速冻5 min，37℃水浴热击5min，之后迅速置于冰水浴中冷却2 min，然后加入1 mLYEB 空白培养基，28℃低速振荡培养4 hr；

7） 6000 rpm离心2 min，弃部分上清，留约200 µL溶液，重悬细胞，涂布于含有相应抗生素的YEB 平板上，28℃倒置培养约36 hr。