基于双功能生物传感器的糖酵解通量监测和动态控制
糖酵解是细胞代谢的基本途径，维持糖酵解通量和生物合成途径的平衡是微生物细胞工厂所涉及的关键问题。这是因为高糖酵解通量会导致过度代谢和细胞过度生长，而低糖酵解速率会导致低细胞生长和产物滴度。因此，使用适时的自主糖酵解通量调节方法合理控制糖酵解通量对于优化细胞工厂和维持细胞稳态极为有益。之前的研究中，很少有调节系统可以解决糖酵解中代谢通量不平衡的问题。
近期，山东大学王倩/祁庆生团队在《Metabolic engineering》杂志上发表了题为“Development of bifunctional biosensors for sensing and dynamic control of glycolysis flux in metabolic engineering”的研究论文。在该研究中，作者设计并构建了一种双功能糖酵解通量生物传感器，通过对启动子和转录调控因子等进行改造之后，得到了一系列具有不同阈值和动力学范围的激活型和抑制型生物传感器。这些经过改造的糖酵解通量生物传感器经过验证表明其能够表征胞内果糖-1，6-二磷酸的浓度。随后，生物传感器用于微调胞内糖酵解通量，以有效平衡两种化学物质的生物合成：甲羟戊酸和N-乙酰葡萄糖胺，受糖酵解通量生物传感器动态控制的大肠杆菌菌株在 1L 发酵罐中的甲羟戊酸产量达到了111.3g/L。
01
内容
糖酵解通量生物传感器的开发（激活型与抑制型）。果糖-1,6-二磷酸(FBP) 是糖酵解的关键中间体，在通量传感中起着至关重要的作用，能充当“通量传感器”。Cra是双功能的全局调控因子，参与激活与糖异生相关的基因和抑制与糖酵解相关的基因，该转录调控因子（TFBS）一般结合在DNA链上。在本研究中，作者根据cra（全局调控因子）、FBP和转录调控因子结合位点（TFBS）之间的关系，构建出能够感知胞内糖酵解通量大小的激活型和抑制型生物传感器。随着糖酵解通量或 FBP 浓度的变化，FBP 分子与 Cra结合并将其与 DNA 分离，进而激活/抑制下游报告基因（图B和D）。当 Cra 作为下游报告基因的阻遏物时，生物传感器的荧光随着胞内FBP浓度的增加而增加，该类型生物传感器被称为激活型生物传感器（图A）。当 Cra 作为激活剂时，生物传感器的荧光随着胞内FBP浓度的增加而降低，该类型生物传感器被称为抑制型生物传感器（图C）。为了阐明糖酵解通量生物传感器的设计原理，作者采用了一系列策略(改造启动子，过表达转录调控因子和突变转录调控因子)来微调动态参数（响应阈值、动力学范围）。最终得到了一系列参数良好的激活型和抑制型生物传感器。同时，作者对胞外添加不同浓度FBP时的胞内FBP浓度进行检测，证明了胞内FBP的浓度变化范围在所构建的生物传感器的检测范围之内。该生物传感器能够感知和动态调节糖酵解通量，以改善糖酵解相关生化物质的生产。
糖酵解通量生物传感器的验证。随后，该生物传感器被应用于胞内糖酵解通量大小的检测。作者通过在大肠杆菌中分别敲除糖酵解途径中的三个关键基因pfkA ,ptsG和pykF构建出了三个具有不同糖酵解通量的菌株，命名为BW-pfkA,BW-ptsG和BW-pykF，用野生型BW25113菌株作为对照。之后，将抑制型生物传感器转入到该三株菌株中，检测到荧光值大小具有明显差异，并且菌株BW-pfkA荧光值>BW-ptsG荧光值>BW-pykF荧光值>BW25113荧光值，这表明了该生物传感器能够准确感知胞内FBP浓度的变化。
糖酵解通量生物传感器动态调控N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）和甲羟戊酸（MVA）的生产。最后，开发的双功能生物传感器用于动态调控N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）和甲羟戊酸（MVA）的生物合成。在N-乙酰葡萄糖胺的生物合成中，当葡萄糖作为唯一碳源时，果糖-6-磷酸是糖酵解途径和 N-乙酰葡萄糖胺合成的竞争性前体，在这种情况下，不仅需要下调 pfkA基因，还需要上调 glmS基因，以提高N-乙酰葡萄糖胺产量。通过用抑制型生物传感器和激活型生物传感器分别精确控制 pfkA 和 glmS 基因的表达，获得了较高的N-乙酰葡萄糖胺产量，表明生物传感器对基因表达的时间和强度进行了及时和适当的调控。在甲羟戊酸动态控制系统中，由于之前构建的EP-bifido途径菌株的pfkA基因被直接敲除掉，菌体生长受到了严重的抑制，因此利用该抑制型生物传感器对菌株pfkA基因在一定的时间进行适当程度的抑制，通过精确调控生产菌株糖酵解途径与生产途径的平衡，最终甲羟戊酸在1L发酵罐中的终产量达到了111.3g/L。
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评述
该研究中构建的双功能糖酵解通量生物传感器成功应用于代谢工程中，在动态调节糖酵解通量以用于各种化学物质的生物合成方面表现出极大优势。在工业应用中。具有不同动态范围和阈值等属性的生物传感器可以为每个代谢通量开关场景提供定制的调节，这样就能够实现精确的动态控制和开发高产菌株。该篇文章还强调了生物传感器的可调原理，可以准确及时地重新编程代谢通量，以最大限度地提高微生物细胞工厂的产量，在微生物细胞工厂构建方面具有重要的意义。
供稿：祝远
编辑：张彤 徐娅 李晓萌
责任编辑：苏田源 崔志勇
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