干货|做流式实验，这几个关键点需要注意！
流式细胞实验技术作为当代最先进的细胞定量分析技术之一,结合高特异性单克隆抗体，为生命科学基础研究和医疗带来了许多具有重大意义的突破，该技术也成为了生命科学和医学科研工作者极为青睐的一种分析手段，越来越多的科研文章中出现流式数据的身影。
不过，由于流式细胞仪比较稀缺，一般实操机会较少，加上流式实验的复杂性，要拿到一个好的流式结果还是不太容易的。这里小P根据研发部门经验，结合流式细胞仪工作原理，整理了几个流式实验最需要注意的几个点，希望对你们有所帮助~流式细胞仪工作原理流式细胞技术（Flow Cytometry，FC）是一门基于流式细胞仪发展而来的实验技术。流式细胞仪主要是由液流系统、光学系统、电子系统构成（部分机型还包含细胞分选系统）。其中液流系统的作用是让细胞能够单列排列依次通过光信号检测点，是光路系统发挥作用的基础；光路系统始于激光器发射器，发射不同波长激光照射到细胞后，产生的光信号（散射光信号和荧光信号）会经过不同光学滤片传输到不同通道探测器；电子系统负责将接受到的光学信号转化为电子信号并进行分析，从混合细胞群中鉴别出不同的亚群；而具有分选功能的流式细胞仪则还能从大量细胞中分选出感兴趣的亚群进行更多研究。因此通过流式细胞仪，我们可以对液体中的悬浮细胞进行快速定量分析和分选。
（左：液流系统；右：光路系统）流式细胞术注意事项★ 样本制备阶段：1. 样品要新鲜采集，注意样本Fc受体封闭流式实验所用样本，不管是独立细胞样本（悬浮细胞、外周血、体液等），还是实体脏器样本，最好均为新鲜采集的样本，因为随着时间推移，样本细胞会发生形态改变、抗原表达下降等现象。并且值得注意的是，单核细胞、巨噬细胞、B 细胞、DC 细胞、粒细胞以及某些肿瘤细胞等，会表达 Fc 受体，与抗体的Fc段发生非特异结合，造成杂信号，此时我们需要对样本进行封闭，消除非特异性信号。
一般情况下，我们可以采用抗CD16和抗CD32单克隆抗体进行封闭，因为CD16和CD32是IgG Fc段的受体。2. 针对不同蛋白，采取不同固定和通透方法细胞内蛋白在染色时，应该针对不同性质蛋白（细胞表面蛋白、胞内蛋白、分泌蛋白、核蛋白等），采取不同的固定和通透方法，以使抗体能接近蛋白靶标。细胞表面蛋白可直接标记；胞内蛋白和核蛋白均需固定、破膜后再标记；针对分泌蛋白，则需要Monensin或者BFA预处理，破坏Na+、H+梯度，阻断高尔基体的转运和分泌，使分泌蛋白滞留胞内。
★ 样本标记阶段：1. 抗体选择流式抗体本身也是抗体，所以选择流式抗体一定要满足抗体选择最基本的条件：靶标特异性，反应种属以及应用实验(流式实验，FC)。流式抗体荧光标记的方式包括直接标记和间接标记两种。在流式实验过程中，尽量减少实验工序和过程，以保证实验的真实和准确性。因此在条件允许的范围内，建议尽量用直接标记的抗体进行实验。2. 荧光染料选择关于荧光染料，我们首选需要根据流式细胞仪来筛选合适波长荧光素，适配仪器激发光和滤光片：
其次，荧光染料发光亮度有强弱差别，常用荧光的强弱如下：PE > APC > Alexa Flour 647 > PE-Cy7 > PerCP-Cy5.5 > Alexa Flour 488 > FITC > APC-Cy7。多色搭配时，我们需要根据靶标性质（表达强弱）挑选荧光素，亮度高荧光素用于低表达蛋白，亮度较弱荧光素用于高表达蛋白。并且，多色搭配时，荧光素之间发射光谱重叠尽量小，如FITC/APC：
★ 实验对照选择：设置合理的对照组是整个流式实验成功的关键，可避免出现假阳性或假阴性结果。流式对照至少有 5 种：空白对照、同型对照、单染对照、荧光减一对照和生物学对照：空白对照 （Blank control)未染色的细胞，用以区分细胞的背景荧光或自发荧光，避免假阳性的结果。可以用来调节各个通道的电压。同型对照 （Isotype control）使用与实验抗体相同种属来源、相同剂量及同种免疫球蛋白的相同亚型的抗体作为对照，用于区分抗体非特异性结合到细胞上而产生的背景荧光。单染对照 （Compensation control）多色分析时做每种荧光素单染的对照，可以显示出不同荧光团之间光谱重叠的水平，并据此去除或补偿它们之间的重叠。荧光减一对照（Fluorescence minus one control）多色分析时减少其中一个通道的荧光抗体的使用，添加其他所有荧光抗体。在多色实验方案中排除干扰，将缺少标记的这一通道的阴阳性分开，便于设门。生物学对照 （Biological control）除研究对象外，其他条件均保持一致的对照实验组，用来确定染色特异性和实验结果的可靠性，如检测刺激后抗原表达量，以未刺激的样本做对照。好啦~以上就是今天想和大家分享的全部内容，感兴趣的小伙伴可以收藏哈~注：针对流式细胞术更多实验技巧以及流式产品推荐，小P这边有整理一份《Proteintech流式抗体产品目录和技术指南》手册，公众号回复“流式”即可获取下载链接~有需要的自取哈~— — — — END — — — —