科研 | Cell：Tau-PTM谱识别阿尔茨海默病患者的异质性和病症的临床阶段
编译：微科盟橙子，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。
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实验设计
1. 采用多种类型的定性和定量MS分析来表征49名AD患者和42名对照受试者的死后脑组织中BA39角回区域Tau的分子特征；
2. 利用FLEXITau测定BA39皮质灰质中肌氨酰可溶和不可溶部分Tau的摩尔浓度和异构体分布；
3. FLEXITau数据使用PLS-DA来确定哪一个可量化的翻译后修饰肽对AD组和对照组的分离最重要；
4. FLEXITau数据的Spearman相关分析、层次聚类分析确定疾病的病理特征；
5. 比较Tau物种的相对肽量以了解每个组分中Tau物种的分子性质。
实验结果
我们采用多种类型的定性和定量MS分析来表征两个队列（包括49名AD患者和42名年龄、死亡间隔（PMI）和性别匹配的对照受试者）的死后脑组织中BA39角回区域Tau的分子特征（表S1和S2）。我们根据死亡前诊断为临床AD或无症状（对照组）的标准选择受试者，另一个标准是死后神经病理学的最终诊断，由相关的脑库确定为AD或未受影响。选定的受试者具有最少的并发病理，并被评估了Braak NFT分期，这是由总Tau的免疫染色和Bielschowsky银染确定NFT的位置而决定的。根据相关标准， AD组需要进行临床高可信度的死后神经病理学诊断，或对照组只是低AD神经病理学改变或Braak 期低于IV期，这样才可以纳入本研究。主成分分析（PCA）分析未显示年龄、PMI或性别对两个队列的Tau-PTM谱的任何影响（图S1）。我们选择角回作为无大量神经元丢失的末期中间病理脑区。为了确定在其他受累脑区是否观察到类似的Tau-PTM和定量图谱，我们采用互补分析法分析了9名对照组和10名AD患者（表S2）额叶回（BA46）区域Tau的分子特征。队列选择、样本制备和MS分析的示意图见图1A。数据和随后的分析表明，两个大脑区域之间共享最高频率的PTM、异构体分布和BA46区域的定量特征（见下文和图S2）。
1. AD组和对照组中Tau浓度和异构体分布
FLEXITau用于测定BA39皮质灰质中肌氨酰可溶和不可溶部分Tau的摩尔浓度（绝对定量）。与对照受试者（组织鲜重约5000 fmol/mg）相比，AD患者（组织鲜重约3000 fmol/mg）的可溶性Tau总量较低（图1B）。与对照组（10 fmol/mg组织鲜重）相比，AD组BA39中病理性不溶性Tau的平均浓度（1000 fmol/mg组织鲜重）高100倍（图1B）。值得注意的是，不溶性Tau在年龄匹配的对照组中也会累积，尽管浓度较低。FLEXITau量化了总共24个Tau肽；其中一些是异构体特异性的，2N4R Tau异构体的总序列覆盖率为61%（图1D）。我们在可溶和不可溶部分中测量0N、1N、2N、3R和4R Tau异构体特异性肽的相对数量（图1C）。有趣的是，在可溶性Tau中，最丰富的物种是1N和4R异构体，而在含有病理性Tau的不溶性部分中，0N和1N Tau与2N异构体相比显著富集，4R异构体与3R异构体相比显著富集。Tau异构体的绝对定量表明，不同异构体在可溶性组分中的分布在含有原纤维的病理性不溶性组分中没有反映出来；相反，1N异构体显著耗尽，0N异构体在不溶性部分富集。这些数据表明0N和4R异构体在AD中更容易聚集，并且这些发现也在来自BA46的肌氨酰不溶性Tau提取物中得到了重现（图S2A）。
2. AD患者Tau-PTMs的定性和定量图谱及其频率
我们对两个不同队列和两个不同脑区的所有Tau异构体进行定性和定量分析，确定了（1）PTM的类型，（2）PTM的定位，（3）PTM受试者的频率，以及（4）基于FLEXITau谱的PTM化学计量。我们在所有样品和组分的88个氨基酸残基上鉴定了95个不同的PTM，从检测到的修饰和未修饰的2N4R Tau肽中累积序列覆盖率为96%（图1E）。数据结果提供了所有修改肽的详细信息，包括肽的置信度评分（表S3）、患者频次（表S4）以及修改是否仅对人类适用（表S5）。尽管已经在Tau上描述了86个磷酸化事件（即，在体内、体外以及跨不同生物体和模型系统），并且已经确定了31个以上的磷酸化位点与生理功能相关，但是到目前为止，只有45个Tau磷酸化事件在病理性人类Tau上被描述。我们的分析将其扩展到BA39病理不溶性Tau的55个磷酸化位点和B46的43个磷酸化位点（图S2C），用泛素化富集法从死后AD脑总裂解物中提取Tau，共鉴定出28个泛素化位点。在这项研究中，我们发现17个泛素位点对病理性Tau有特异性（BA46中有14个；图S2C），而17个泛素化位点中有16个位于微管结合域（MBD），它构成了微丝的核心。我们在BA39和BA46中分别发现了19个和18个不同的乙酰化位点。有趣的是，一些乙酰化位点在病理性Tau中也被泛素化，同时我们检测到4个甲基化位点。
这95例PTM的患者频率如图1F所示（对于BA46，参见图S2C），其中我们比较了AD和对照受试者的不溶性Tau。频率是了解不同PTM的病理学和患者群体异质性的关键。88个修饰位点中有一些是单一类型的PTM修饰；然而，另一些可以携带多种类型的修饰，如K311，它可以被泛素化或乙酰化。在两个队列的一个或两个患者中都有多个位点被观察到，因此不太可能与疾病相关，例如S113处的磷酸化。FLEXITau-MS数据（队列1和队列2）中肽修饰程度中位数的热图与频率数据重叠，以评估PTMs的化学计量比。已知与疾病相关的显著PTM，例如含有磷酸化位点S199、S202和T205的AT8表位，在患者群体中发现具有高频率和高化学计量比。鉴于此，最相关的PTM是那些在AD受试者中显示出高频率和程度的修饰的PTM。
乙酰化的高频率发生在R4区域，包括K353、K369、K370和K375位点，而泛素化发生在R1 R3。这也反映在额回（BA46）（图S2C）。有趣的是，在R3中，K311位点的六肽VQIVYK显示乙酰化和泛素化，泛素化倾向增加。在图1F中，频率图下方显示的FLEXITau数据显示了49例AD和42例对照患者PTM的修改程度，并与PTM频率一致。
磷酸化位点在富含脯氨酸区（PRR）聚集频率最高，而在AD的FLEXITau数据中我们观察到覆盖位点（S198、S199、S202、T205）和（S212、S214、S217）的多肽（195-209）和（212-224）>90%被修饰；此外，跨越氨基酸残基的区域[396-406]在S396、S400、T403和S404处具有高频率的磷酸化，并且显示>90%的修饰程度（图1F）。这一观察结果也适用于BA46（图S2C）。有趣的是，对于这两个大脑区域（图1F；图S2C），在T181和T231等对照组的不溶性Tau中存在一些高频PTM。在一些对照受试者中，这些磷酸肽进一步磷酸化，并显示与病理性Tau相关的一些相同的PTM。在20%和40%的对照组中观察到肽（195-209）中S198、S199、S202和T205处的这些磷酸化位点，表明在少数对照组中观察到早期疾病。
图1 AD患者和健康对照组(CTR)死后角回(BA39)组织中提取的肌氨酰可溶性和非可溶性Tau蛋白的亚型分布和PTMs的分子特征
（A）研究和工作流程示意图概述。（B）通过FLEXITau量化的总绝对不溶性Tau丰度在AD组显著高于对照组（t检验），而可溶性Tau相对物在AD组低于对照组（t检验）。（C）人角回组织中肌氨酰不溶性Tau的异构体组成表明，致病性Tau聚集体在Tau病谱中主要由0N和1N异构体（黄色方框图）和4R异构体（蓝色方框图）组成，而1N和4R是肌氨酰可溶部分的主要形式。（D）Tau的肽坐标概述，包括在靶向定量FLEXITau分析中测量的异构体特异性肽。亚型特异区域以黄色和蓝色显示。肽的氨基酸位置投射到括号中Tau的2N4R序列上。（E）从AD脑组织（BA39和BA46）提取的所有MS分析Tau物种（可溶性、不溶性、LMW、HMW和MC1分离Tau）的累积PTM图。（F）从Tau的N端到C端的PTM患者频率显示AD的2%-90%的广泛频率范围。一些高频位点是已知的AD表位，例如202-205磷酸化位点（AT8抗体），精确定位重要的PTM特异性位点。
3. 个体Tau-PTM谱显示异质性并反映疾病进展
图2A描述了在两个队列的AD和对照受试者中确定的Tau-PTM的无监督层次聚类分析。左面板显示PTM由PTM特征聚集，而右面板显示PTM特征从Tau的N端到C端排列。图的左侧提供了受试者（23例AD患者和27例对照组）有关临床和病理诊断以及Braak分期的信息。此外，还显示了每个样本中测得的Ab和Tau水平（粉色和蓝色热图）。ANOVA分析显示，在Braak期较高的集群中，Tau和Ab水平较高，Tau-PTM水平升高（图2B）。大部分AD患者分为两大类（图2A、b和c），而对照组分为两大类（图2A、A和d）。
对照组a组的PTM数量最少，我们观察到肽（225-242）在（S231或S235）处具有单一磷酸化，一些受试者在T181处具有磷酸化。a组主要由Braak 0 III期患者组成。d组不同于AT8抗体（d-V:S199和S202）、PHF1抗体（d-III:S396、S400、T403和S404）、AT120抗体（d-III:T212和T217）和单个S262磷酸化确定的表位出现磷酸化。a组对照受试者的Tau显示与正常生理功能相关的磷酸化位点，而d组对照显示与病理相关的其他位点。d组的大多数受试者被列为对照组，这些PTM可能是病理学的最早征象。d组包括10例有症状的晚期AD患者Braak IV-VI和16例无症状对照组Braak 0-II。这10名有症状的患者在MBD结构域中表现出一些泛素化，这可能是有症状患者的特征。16名无症状患者表现出PRR磷酸化增加，例如T181，据报道，轻度认知障碍（MCI）患者的死前血浆中的PRR磷酸化增加。在d组以及AD b组和c组有症状的患者中也观察到PRR的磷酸化增加；因此，尽管患者没有被诊断为有症状，但他们在死亡时可能表现出早期认知缺陷。多数AD患者分为b、c组，少数与对照组d组，表现为早期病理改变，d组中一些临床无症状的受试者表现出与AD相关的特征III PTM。
b组的Braak期为V期，而c组的Braak期为VI期，这些组中的受试者在BA39中的Tau和淀粉样蛋白负荷明显高于a组和d组的受试者（图2B）。簇b和簇c的特征是标记IV的MBD结构域中的PTM。这些PTM包括发生在相邻位点（S262和S263）的磷酸化、乙酰化（K311、K353和K369）和泛素化（K259、K267、K311和K317），这些PTM在其他集群中都没有被识别。先前在PRR簇d（S231、S235、S212和S217）和PHF1表位（S396、S400、T403和S404）中发现的磷酸化位点在簇b和簇c中高度聚集。簇b和簇c显示许多相同的PTM；然而，在簇c中，我们观察到几个PTM的频率较高，包括T175、S237和K281（以及S113、S191和K281）T205，在较低的化学计量比下很难观察到，特别是因为S113是在一个0NTau肽上发现的磷酸化位点）。T175、S237和K281在I、II和IV PTM中的较高占有率与有症状的晚期疾病（Braak阶段VI）相关。
我们使用偏最小二乘鉴别分析（PLS-DA）来确定哪一个可量化的翻译后修饰肽对AD和对照组的分离最重要（图2C）。该分析提供了一个可变的重要度投影（VIP）评分，它提供了一个衡量每个修饰肽在区分AD组和对照组的重要性的指标。当使用翻译后修饰肽的定量数据区分AD组和对照组时，残基K311和K317处的单和双泛素化肽以及两个磷酸肽（T217和S262）可以最明显地区别两组。
有趣的是，Tau的可溶性部分也被定性和定量MS研究，AD组和对照组受试者的PTM图显示，在可溶性部分中检测到的PTMs定性和定量没有差异（图S3）。这一观察结果与PTMs与可溶性组分相关的提示一致，PTMs与正常生理Tau功能相关。尽管PLS-DA在不溶性组分（包括残基K311和K317处的泛素化肽）中鉴定的排名靠前的PTM可能是诊断的生物标记物，但需要对相关生物流体样本进行适当的研究。
图2 不溶性Tau的PTM表现为异质性，将受试者分为不同的组，反映了疾病的进展
（A）左图根据PTM在层次聚类中的重要性对PTMs进行排序，而右图则根据其在2N4R Tau上的位置对PTMs进行排序。右边的图例提供了亚型、PTM类型、病理诊断、临床诊断[对照(CTR)、轻度认知障碍(MCI) Pick s病(PiD)、帕金森病(PD)]和Braak分期。PTM的类型和亚型在顶部的条形图中用颜色标记，诊断结果显示在左侧。来自49名AD患者和42名年龄匹配的健康受试者的MS的Tau PTM图谱数据，使用Jaccard二元聚类(橙色，PTM识别；紫色，PTM未识别)。该分析基于独特的Tau PTM特征将受试者分成子组，每个子组由多个PTMs组合组成。将受试者分为a、b、c、d四组，其中c组为制动分期最高的组，a组为制动分期最低的组。在左面板下方，我们列出了5种PTMs组合，它们将集群分为4组。（B）方差分析（Kruskal-Wallis）显示，b和c组的Tau和淀粉样蛋白负荷高于a和d组。这对于Tau在所有组中，Aβ在a和b组之间是很重要的。（C）从MaxQuant得到的修饰肽强度的PLS-DA将受试者根据其病理诊断进行分离，确定25个肽为最具鉴别能力的修饰肽。VIP图位于右侧，并根据研究的2组患者中AD与对照受试者分离时的重要性对这些PTM进行排序。红色和蓝色方块表示在各自的疾病组中肽是减少(红色)还是增加(蓝色)。
4. Tau肽化学计量数据确定疾病的关键病理特征
两个队列中个体患者的FLEXITau数据如图3所示（队列2见图S4，BA46见图S2D）。FLEXITau数据的层次聚类分析显示为热图，修改程度最高的显示为红色，最低的显示为蓝色。在左边，我们对肽进行了分级聚类，指出了区分簇的肽，右边描述了从Tau的N末端到C末端的修饰程度。热图上显示的AD患者Tau-PTM修饰化学计量比与对照组非常不同，以至于它们在层次簇的第一个分支处分离。AD的一个决定性特征是从氨基酸（aa）195-224（肽195-209；212-221/224）延伸的PRR的高度修饰；此外，来自aa 243-370的R1 R4在AD患者中高度富集（243-254、260-267、281/282-290、299-317、306-317和354 369/370）（图3A；图S4），并且该区域中的大部分肽是高度修饰的R2 R3（260-267、281-290、282-290、299-317和306-317）。与AD的C末端一样，N-特异性区域在很大程度上代表性不足（45-67、68-87和88-126）。MBR肽富集、PRR高度修饰以及N-特异性区域和C末端表达不足的特征在队列2（图S4A）和BA46 FLEXITau聚类分析（图S2D）中重复。我们采用PLS-DA研究哪些变量对AD组和对照组的分离最重要（图3B；图S4B）。该分析提供了一个VIP评分，该评分提供了区分AD组和对照组时每个肽重要性的度量（图3B；图S4B）。在区分AD组和对照组时，R4肽14（354-369）、含有S212、S214、S217和T220磷酸基的PRR肽8（212-221）和C端肽17（407-437）是最明显的（图3B）。
Spearman相关分析表明，PRR和C末端肽与两个队列中MBD未修饰肽丰度的增加呈反相关（图3C和3D；图S4C），因为C末端和PRR显示出高修饰化学计量比，如未修饰肽丰度的减少所反映。Tau磷酸化的增加可能与中和MBD结构域中的电荷以促进聚集有关，人们可以调用发夹模型的变体来支持这一观点；PRR和C末端肽强度相互关联，支持这种关系（图3C和3D；图S4C）。
更仔细的检查显示AD患者和对照组的化学计量的异质性。尽管与所有对照组相比，未修饰的C末端肽在AD中的丰度较低，但存在一个C末端完全未修饰的对照组簇（图3A），而另一个对照组簇显示了一些处理过程。除此C末端肽外，所有对照组似乎显示出相同的肽化学计量的一般模式；例如，外显子1肽（6-23）显示出比所有其他AD患者更少的修饰程度，并且所有对照组的PRR都有一定程度的修饰。这表明C末端的修饰是衰老和AD病理过程中的早期事件，很可能归因于D418和D421的caspase-3和-6断裂。
最后，我们使用随机梯度下降法（SGD）训练了一个分类器，对队列1的FLEXITau数据进行了分类，并在队列2中进行了测试。该分类器能够在两个队列中预测诊断病理学，准确度>0.92（图3E）。
图3 对AD患者和年龄匹配的对照组的FLEXITau分析显示，定量校正曲线存在异质性
（A）FLEXITau提供了Tau中肽修饰程度的度量。左面板根据层次聚类中肽的重要性对每个测量肽的修饰程度进行排序，而右边的热图描述了肽在2N4R Tau上的位置。右边的图例显示了每个肽的修饰程度、病理诊断、临床诊断以及队列1受试者的Braak分期(表S1)。使用FLEXITau在队列1(29例AD vs 28例CTR受试者)中测量Tau肽的无监督欧几里得层次聚类。FLEXITau聚类分析将受试者分为3个主要组(x、y和z)，最显著的特征是C端肽、R3 R4在MBD和PRR中的化学计量特征。（B）FLEXITau肽修饰程度的PLS-DA根据病理诊断将受试者分开，并确定三种肽最具鉴别能力（VIP评分图）。红色和蓝色方块表示在各自的疾病组中肽是减少(红色)还是增加(蓝色)。（C）Spearman相关分析显示PRR和1N/2N特异性肽呈反相关，两个队列的MBD丰度增加。（D）队列1中相关肽和反相关肽的相关图。FLEXITau数据揭示PRR和C端PTM范围的增加以及AD不溶性聚集物中MBD的富集，并提供了有关修饰过程的信息。（E）基于FLEXITau数据的10倍交叉验证SGD模型预测AD和对照组的分类性能。模型在第1组进行训练，在第2组进行测试，结果AD和对照组的AUC分别为0.934和0.985。
5. 鉴定与大小分级Tau中“种子”活性相关的PTM
上述来自AD和对照组的肌氨酰不溶性（纤维化）Tau的结果表明，PTM在纤维化过程中存在过程性和发生顺序。为了进一步检查这些结果，并使用我们的定量和定性平台确定与“种子”活性相关的最小PTM集，我们检查了一系列与不同分子量和“种子”活性相关的不同种类的Tau，包括来自人类患者的大小分级Tau，如前所述（图4A）。我们分析了四种不同的Tau组分：（1）肌氨酰可溶性Tau（可溶性），（2）MC1分离的Tau（通过MC1抗体免疫亲和柱从可溶性组分中分离），（3）可溶性低分子量（LMW）Tau（50 kDa）和（4）寡聚高分子量（HMW）Tau（>120 kDa）；后两种组分通过尺寸排除色谱法。我们将这四种Tau组分的数据与我们的不溶性Tau分离物（纤维状Tau，“不溶性”）的数据进行比较。
为了更好地了解每个组分中Tau物种的分子性质，我们比较了被测物种的相对肽量（图4B；图S2B）。当我们比较左上图中LMW和HMW Tau物种的Tau谱时，我们发现从N端到PRR末端的未修饰的固有无序结构域在LMW Tau中过度表达，这在生物传感器分析中是不合适的，而修饰的MBD在PRR中过度表达HMW-Tau “种子”活性组分。当以这种方式比较AD和对照受试者的肌氨酰不溶性部分时，我们得到了类似的结果。两种“种子”活性组分HMW Tau和较大的纤维化不溶性Tau的比较分析显示了类似的模式；然而，MBD在不溶性Tau组分中更为富集，肽260-267的表达不足，表明该肽的磷酸化化学计量比更高（S262和T263）。五个组分中每个组分的Tau肽的PTM范围如图4C所示。不适合接种的AD和对照Tau-肌氨酰可溶性组分没有显示差异；两者都在N-末端区域富集（图4C）。这些定量数据表明Tau的N末端区域与“种子”活性呈负相关。相反，高浓度MBD与种子活力和纤维大小呈正相关。在图4D中，我们绘制了所述5种Tau物种的修饰图谱。LMW-Tau与肌氨酰可溶性组分的Tau具有相似的修饰模式，在LMW和肌氨酰可溶性组分中，PRR中的5个磷酸化位点（T181、S198、S199、S202和T231）是一致观察到的位点。这些Tau组分在生物传感器分析中不具有正的“种子”活性。HMW-Tau被认为是寡聚Tau，在MBD中有20个磷酸化位点（6个在N末端，10个在PRR，4个在C末端），3个乙酰化位点和4个泛素位点。根据在其他组分中的观察，在使用这些技术分离的Tau分子总体相似的背景下，HMW组分中PTM的具体模式存在一些患者之间的差异。这种HMW寡聚Tau形式似乎具有与接种相关的最小Tau-PTM集合；我们观察到与LMW和肌氨酰可溶性接种阴性组分相比，乙酰化和泛素化对于接种阳性Tau而言是独特的。这些修饰图谱最显著的方面与我们对肌氨酰不溶性Tau的分析（图1、2和3）一致，即PRR似乎随着Tau聚集体的增大而累积磷酸化位点，而MBD似乎随着Tau聚集体的增大而累积乙酰化和泛素化。有趣的是，电荷中和PTM，如乙酰化和泛素化，主要存在于Tau（K353、K369和K370）的核心囊（345-375）中。无序预测和电荷计算揭示MBD变为无效区域，特别是残基305-350无序化（图S5）。
6. 人类病理性Tau的化学计量PTM图谱确定了疾病进展的关键步骤
作为多重分析的总结，在图5A和5B中，我们描述了病理性Tau的定性和定量MS数据中观察到的最显著特征。
在图5A中，我们描述了层次聚类分析建议的Tau-PTM剖面的过程性质。这些数据表明，在疾病的不同阶段观察到的PTM的数量和这些PTM位点的占有率增加，这为聚集过程和疾病进展提供了见解。a组平均Braak期最低为0i，仅显示Tau（BA39）磷酸化，PRR有3个位点，aa400404有3个位点。在d组，平均Braak期为III-IV的受试者中，我们观察到在S396的PRR结构域和C末端增加了6个额外的磷酸化位点。在b组中，平均Braak期为V或VI，我们观察到MBD多个位点出现乙酰化和泛素化。在c组中，在VI的最高Braak期，我们观察到PTM从N端到c端的总体增加。
在图5B中，我们总结了FLEXITau分析结果。一般来说，定性数据与FLEXITau分析的定量数据一致。然而，在比较FLEXITau数据和PTM映射数据时，有一些有趣的观察结果。FLEXITau数据很重要，因为它们确定了与病理学相关的Tau区域；例如，被确定为定义AD的三个肽是bd结构域，在AD受试者中增加；PRR，在疾病中高度修饰；以及最末端的C末端肽，在其未修饰的形式中表达不足，可以被检测解释为半胱氨酸蛋白酶断裂。
在图5C中，我们提出了AD中Tau原纤维形成的模型。我们的分析显示0N和4R亚型易于聚集；此外，PTM的逐步级联，包括C末端裂解和PRR中的负电荷磷酸化，然后是富集MBR中的电荷中和乙酰化和泛素化，是Tau原纤维形成和AD疾病进展过程中的渐进步骤。
图5 疾病患者和对照患者的比较化学计量Tau-PTM图确定了临界PTM和聚集相关区域
（A）不同PTM在疾病不同阶段的顺序累积示意图。随着疾病的进展，PRR磷酸化的增加紧接着是MBD中的乙酰化和泛素化。（B）总结FLEXITau数据的示意图，显示了导致患者间Tau聚集的三步过程。1N和2N异构体在所有不溶性Tau中都表达不足。观察到的早期事件是C端分裂，随后是PRR磷酸化和MBD富集。与对照组相比，AD患者的MBD明显增加。（C）基于我们的化学计量PTM分析，我们提出了Tau纤维形成的模型。0N和4R亚型易于聚集。PTMs级联，包括C端切割，PRR中带负电荷的磷酸化，然后在富集的MBR中电荷中和乙酰化和泛素化，是Tau纤维形成和AD疾病进展过程中的进展步骤。
讨论
了解Tau蛋白在病理学和“种子”活性中的普遍存在是很重要的，特别是因为药物研究正转向使用抗体和小分子将Tau作为治疗靶点。因为只有 0.1%的抗体能穿过血脑屏障（BBB），因此提高预期治疗抗体对Tau病理形态的特异性和亲和力是成功治疗的关键。我们的分析为人类疾病病理性Tau的分子特征提供了前所未有的定量和定性的观点，这对于合理设计抗体和小分子治疗剂以及诊断Tau至关重要。例如，我们的数据显示，横跨N末端区域（包括1N和2N区域）的未修饰外显子1、2和3肽的表达不足（>50%），因此该区域的N末端抗体被预测为AD的低效治疗剂。此外，考虑到未修饰的1N/2N区在类朊病毒、种子阳性Tau聚集体和寡聚体种子中的含量较低，未修饰的1N/2N区的N端抗体可能无法通过种子机制有效地阻止疾病进展。
我们对91名受试者（49名ADA受试者和42名对照受试者）的病理性Tau进行了分析，在88个氨基酸残基上累计识别出95个PTM。我们沿着Tau蛋白的长度定位了55个磷酸化位点，17个泛素化位点，19个乙酰化位点和4个甲基化位点。（图1E）。PTM图谱揭示了不同PTM在相同氨基酸残基上的广泛相互作用（图1E），这一观察结果与最近在小鼠中的Tau-PTM图谱结果部分一致。有趣的是，从人脑组织分离的病理性Tau的PTM谱在受试者之间是异质的；然而，对AD组和对照组中每个PTM的频率的分析显示了一个惊人的模式，确定了AD中的共同特征。在PRR和C末端尾部观察到的磷酸化频率最高，而在BD中乙酰化和泛素化聚集严重，已经证明形成了Tau丝的核心区域。与之前在小鼠中进行的生化研究一致，所确定的大多数人类Tau乙酰化位点是交替泛素化的（图1E），这些位点包括三个KXGS基序，已知它们调节神经轴突延伸和Tau与微管的结合。在这两个队列中我们都发现了被广泛研究的在AD中很重要的表位，如AT8和AT180。重要的是，我们的数据还确定了其他研究较少的同样高频率的表位，包括K311和K317的泛素化和K369的乙酰化。基于PTM存在或不存在的无监督分析我们将受试者分为4个主要组，并显示在每个组中都有PTM的特定组合，PTM的集合在很大程度上反映了疾病的进展，因此可能与疾病的分期有关。重要的是，这些数据表明早期干预可能需要不同于晚期AD的治疗药物，因为与疾病的每个阶段相关的PTM谱有明显的差异。探索这些PTM的作用可能提供疾病病理学和进展的机制性见解；此外，我们的数据为人体组织病理性Tau提供了一个全面的PTM图谱，并将有助于未来全身和近端体液的生物标志物研究，如脑脊液（CSF）、外周血单个核细胞（PBMC）、血小板和血液的诊断，并将促进正在进行的诊断研究。
对从患者和对照受试者中分离出的大小分级的“种子”活性和非“种子”活性Tau物种的分析表明，如图4所示，“种子”活性（HMW和肌氨酰不溶性Tau）和非“种子”活性Tau物种（LMW和肌氨酰可溶Tau）的PTM landscape不同。我们确定了与朊样活性相关的最小PTM集，并且我们的数据表明这些修饰可以定义新的表位，以治疗性抗体为靶点，消除疾病的传播。此外，这些不同Tau物种的PTM landscape提供了证据，这些不同Tau物种的PTMs分布提供了证据，表明随着Tau物种的大小逐渐增加，PTMs逐渐积累，从低分子量Tau、高分子量Tau和MC1纯化Tau到电泳不溶性纤维Tau。在MC1纯化的Tau中鉴定的PTM与从肌氨酰不溶性部分提取的AD原纤维Tau中鉴定的PTM基本相同。这些数据，结合播种能力研究，提供了形成低聚物所需的最小PTM集，如HMW-Tau所示。尽管在HMW-Tau的MBD中观察到乙酰化和泛素化，但后一种修饰似乎仅限于有能力的物种。泛素化是唯一的“种子”活性Tau，而乙酰化也观察到非“种子”活性Tau。Tau在MBD中有19个赖氨酸残基，在生理pH值下会带正电荷，并经历排斥静电，阻止b片原纤结构的形成。为了克服这些静电并促进聚集，需要MBD的电荷中和，并且已经描述了促进聚集的阴离子实验辅助因子模型：肝素和RNA或其相关颗粒。我们的数据表明，多种PTM可能有助于MBD的电荷中和，包括磷酸化、乙酰化和泛素化。PRR中磷酸化的增加导致负电荷的积累，我们假设，负电荷可以中和MBD中的正电荷，就像肝素中和这个区域的正电荷以诱导Tau纤维化一样。我们还观察到MBD积累了电荷中和PTM，如乙酰化和泛素化。K311、K317、K321和K369处的电荷中和PTMs泛素化/乙酰化将减少纤维形成的动力学障碍。此外，这些修饰的增加与聚合物长度的增加和与疾病进展相关的病理性Tau丰度的增加正相关。这些PTM的患者频率很高；然而，这些位点的化学计量比为50%；因此，纤维中的每一秒Tau分子都被修饰。这些数据表明，在原纤维中所描述的Tau分子并不是每个都被乙酰化或泛素化。
Tau的无序区域横跨N末端和PRR。我们对不同Tau亚型的定量分析表明，4R亚型占优势，2N和1N区域与“种子”活性Tau的丰度呈负相关，而PRR中的磷酸化与病理高度相关。这些数据表明，0N和4R版本，当磷酸化，不再是无序的，可以采取一种结构能够形成原纤维。因此，原纤维形成的另一种途径涉及高度磷酸化、带负电的PRR结构域，基于先前描述的发夹结构进行修正后折叠MBD来中和MBD赖氨酸的正电荷，其中磷酸化的C末端和磷酸化的PRR结构域稳定了MBD的正电荷。
我们的数据支持一个过程模型，其中0N和4R易于聚集并具有初始磷酸化，C末端的裂解使进一步的原纤维化，随后在PRR结构域中增加磷酸化，在MBD中乙酰化和泛素化，消除带正电荷赖氨酸残基的静电排斥在这个区域，促进Tau纤维化。这些数据为每个疾病阶段的诊断标准和治疗策略提供了指南；例如，需要开发针对AD每个疾病阶段的抗体或小分子治疗剂。总的来说，MS是理解Tau聚集机制的有力工具，并可能使未来的体内诊断和预后工具以及治疗方法成为可能。