科研 | Angew.Chem. Int. Ed.：含氟试剂在结构蛋白质组学中的应用
编译：阿昊，编辑：Emma、江舜尧。
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结构蛋白质组学（Structuralproteomics）是指为了了解蛋白质序列、结构和功能之间的关系而对蛋白质结构进行研究。化学标记与质谱分析相结合已成为结构蛋白质组学中广泛应用的有力工具。成功的关键是一种生物相容性试剂，它能在不影响蛋白质高阶结构的情况下修饰蛋白质。在这篇综述中，我们描述了几种可用于结构蛋白质组学的含氟试剂。我们围绕四种基于质谱的技术来叙述它们的应用：a）亲和标记，b）基于活性的蛋白质分析（ABPP），c）蛋白质足迹和d）蛋白质交联。本文旨在综述含氟试剂在蛋白质结构研究中的研究、开发和应用。
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实验结果
1. 前言
Marc Wilkins于1996年提出了蛋白质组学的概念。两种转化技术对蛋白质组学的发展至关重要：（1）使用质谱（MS）与“软”电喷雾电离（ESI）或Trix辅助激光解吸/电离（MALDI）相结合的肽测序策略；（2）液相色谱（LC）的改进、小型化和自动化。总之，这些技术使肽的快速鉴定成为可能。
本文综述了几种重要的含氟物种及其在结构蛋白质组学中的应用。有些试剂是可光活化的（例如，二嗪、叠氮化物、三氟甲基自由基），而一些是亲电试剂（例如硫（VI）氟化物、氟膦酸盐、氟甲基酮）。为了强调化学设计的可能性，我们使用基于质谱的蛋白质组学方法，根据四个应用进行综述：（1）亲和标记，（2）基于活性的蛋白质分析（ABPP），（3）蛋白质足迹，和（4）蛋白质交联。
2. 亲和力标记的应用
“亲和力标记”（Affinity Labelling）最早在1962年被辛格提出，包括抗体的亲和力标记。其概念是在蛋白质配体上放置一个化学反应“把手”，并启动靶蛋白在特定配体上的共价修饰。
衍生物二氮嗪是光亲和标记中最常用的光活化基团。在~360nm紫外光照射下，通过Expelling 2进行反应，以此迅速插入目标的O-H、N-H或C-H键。含氟二氮杂环化合物，即3-三氟甲基-3-苯基二嗪（TPD）。与其他化合物相比，TPD具有更好的化学和热稳定性（图1a）。相邻的芳基和三氟甲基（-CF3）稳定了紫外光照射形成的重氮中间体。由于TPD具有空间位阻，因此将CF3-二氮杂环直接连接到芳香环上是可行的方法之一。有研究者开发了基于TPD的探针，其中包含一个chromon-4-one支架（图1b）。他们发现CF3-二氮嗪基直接取代了氯化物atR1。另一个方法是调节侧链涉及CF3-二氮杂环基。有研究者开发了一种新的异丙酚类似物，将CF3-二氮嗪用作“弹头”。尽管CF3-二氮嗪在对位或间位直接连接产生了一种无法模拟母体的化合物，但在保持药效的同时取代了邻位的一个异丙基侧链，从而实现了高效的光标记（图1c）。
图1（a）TPD的光化学途径。相邻的芳基和三氟甲基（-CF3）稳定了重氮中间体，避免了副重排反应。（b-d）三种策略，包括基于TPDs的探针的diazines结构优化。
含氟化合物常被用作吸入式麻醉剂（inhaledanesthetics）。氟化增加了麻醉剂效力并保留了药理学特性。氟取代化合物通常不可燃，有助于麻醉诱导，并允许精确控制麻醉剂浓度。如前所述，一些研究人员利用氟的特性，将F与末端二嗪基相邻，以提高标记效率。不良反应是分子内C-H插入以生成烯烃（图2a，路径B）。有研究者开发了一种用于光亲和标记的异氟醚类似物，叠氮异氟烷（图2b）。这种异氟醚类似物在蝌蚪体内的效力甚至比母体异氟醚更高，这表明光亲和标记可以维持药物的药效，并且结合位置与亲本有关化合物。
叠氮化物是光标记研究中最常见的硝基传递前体。芳基叠氮化物在光标记中占主导地位，而烷基叠氮化物稳定性较差。芳基叠氮化物的一个缺点是：初期的单线态氮烯二烯会重新排列成烯酮胺类化合物，这种烯酮胺只与亲核试剂反应，而不与无处不在的C-H键反应（图3）。这种不受欢迎的排列降低了标记效率。氟化芳基叠氮化物克服了这一局限性，因为氟取代基有利于芳基硝基丁二烯的键插入并削弱环的膨胀。有研究者证实了C-H或N-H插入（图3a）是氟化芳基叠氮化物的主要途径，并且环膨胀是迟钝的（图3b）。
图3 氟化苯基叠氮化物的光化学反应。氟在芳环上的取代可以阻止不希望发生的侧重排反应，生成烯酮亚胺。
磺酰氟（SF）（图4）可追溯到100年前用于染料。SF至少有四个特点：1）抗还原性，（2）热力学稳定性，（3）在硫中几乎唯一的反应性，以及（4）与F的强H键。磺酰亚胺基氟化物是SF的一种仿制品，具有类似的性能。侧链上的官能团可以催化水解（路径a）或共价加合（路径b）。SuFEx最吸引人的特性是它的邻近驱动反应性。也就是说，SuFEx试剂不轻易与蛋白质发生反应，Lys15和Glu54在甲状腺转运蛋白（TTR）中形成盐桥，并通过Lys15来激活SF（图5）。如果附近没有反应性残余物，其也会催化SF水解。
SF与Lys反应形成稳定的加合物。对于丝氨酸，自然界对蛋白质催化位点的设计是如此复杂，以至于它也允许级联反应。有研究者将肽磺酰氟（PSF）与结晶免疫蛋白酶体（iCP）孵育，并通过MS分析意外的发现质量转移（失水），而不是PSF的共价加合物。级联机制在活性位点产生交联（图6）。值得注意的是，这种出乎意料的修饰（净失水）甚至可以在X射线晶体结构中观察到，揭示了蛋白酶体亚基β5的分子交联。
图4（a）SuFEx反应机理。（b）硫（VI）氟化物试剂进行点击化学反应。
图5 SF探针在TTR结合腔中的潜在命运。
图6 iCP蛋白酶体活性部位的PSF产生氮丙啶的机制。乙酮（T1）经PSF磺酰化，然后由T1的胺基进行分子内取代，得到氮丙啶。
3. 在基于活性的蛋白质分析（ABPP）中的应用
基于活性的蛋白质组学（ABPP）是一种广泛描述天然生物系统中酶活性的化学蛋白质组学策略。虽然ABPP在概念上类似于传统的亲和力标记（体外），但其目的是在蛋白质组尺度上表征酶的功能。设计中有一个探针分子，它包含一个核心单元、一个链接器和一个标签（图7a）。根据与酶形成共价键的策略，有三种类型的亲电和含氟ABPP试剂：（1）氟磷酸盐（FP）（2）氟甲基酮（FMK）和（3）SuFEx试剂（图7b）。
图7（a）ABPP探针的结构，包含一个核心单元（三角形）、一个链接器和一个报告标签（椭圆形）。核心单元包含一个药效团和一个“弹头”，使探针能够共价连接到复合物上。连接器用于调节核心单元和报告标签之间的空间，便于下游蛋白质的富集和分析。（b）常见的含氟ABPP探针弹头。
FPs是一类以丝氨酸水解酶（SH）为靶的亲电膦酸盐（图8）。FP的使用可以追溯到20世纪50年代初，氟磷酸二异丙酯首次用于抑制SHH，后来，研究者开发了FP-peg生物素，当与可溶性蛋白质组和膜蛋白组一起孵育时，它能产生与探针相似的“最大覆盖率”。
图8 FP的结构探针。FP衍生物相对稳定，但在潮湿或碱性溶液中会发生水解，生成氢氟酸。
虽然FPs对SH有响应，但半胱氨酸蛋白酶（CP）对FP没有反应。利用FMK对CP进行分析（图9），研究者开发了一种含有FMK的腺嘌呤类似物（13，14）。与氯甲基酮（CMK）相比，FMK在生物环境中具有更大的化学稳定性。为了提高FMK细胞膜的通透性，该小组开发了包含膜透性荧光标记的FMK-BODIPY探针15。
图9 从腺嘌呤开始选择的FMK探针的结构。
在硫（Ⅵ）氟化物（图4b）中，SF和芳基氟硫酸盐（AF）在ABPP中有明显的区别。SF是用来探测赖氨酸、酪氨酸或丝氨酸的。有研究者优化了探针16（图10），以修改赖氨酸并使活细胞中的广谱激酶谱图成为可能。另一些研究者开发了探针17，第一次以酪氨酸为靶点。对于丝氨酸标记，探针18（PMSF）。可以标记丝氨酸蛋白酶活性部位的丝氨酸残基。然而，PMSF在水溶液中不稳定。氨基酸评估证明了除了SF水解以外，与N-乙酰化丝氨酸的反应没有其他反应。N-乙酰半胱氨酸（NAC）对SF最具反应性，但产物易水解。AF相对稳定，氟硫酸盐-L-酪氨酸可以遗传编码到蛋白质中，作为一种潜在的蛋白质交联电泳，证明了它本质上的低化学反应性和代谢稳定性。ABPP的前景是它可以捕捉蛋白质组的时间变异性。
图10 ABPP用SuFEx试剂的结构
4. 蛋白质足迹法（Protein Footprinting）的应用
“足迹”通过使用化学反应来确定蛋白质骨架或侧链的溶剂可及性来表征蛋白质结构。足迹包含不同的标记策略，这取决于所用的化学方法。羟基自由基足迹法（HRF）是不可逆修饰蛋白质的最常见方法。其他化学足迹试剂范围适中，可在FPOP平台上生成的活性与高度特异性的氨基酸标记试剂（如焦碳酸二乙酯，甘氨酸乙酯，苄基酰肼）。相反，后者是由溶液中的化学反应缓慢生成的。随着研究人员寻求更广泛的覆盖范围，人们对新试剂开发的兴趣与日俱增。
尽管三氟甲基（-CF3）是一个多功能基序，在医药、农药和特种材料中有着广泛的应用，但它在大分子（即蛋白质和肽）中的研究仍然很少。有研究者发现三氟化钠（Langlois的试剂）在加入细胞裂解液时会修饰咖啡碱。在另一个例子中，Tris缓冲液中的β-内酰胺酶被标记为·CF3并保持功能活性。
图11 自由基三氟甲基化的机理。
碳稀（Carbenes）是由二氮嗪前体的光分解产生的，是蛋白质足迹研究的广泛的替代品。重氮甲烷（CH2N2）是最小的碳稀前体。尽管该试剂提供了广泛的标记，但特别难以定量。使用荧光化学在碳稀足迹分析中具有优势。足迹法设计基于两个原则：（1）芳香环与蛋白质上的疏水斑块相互作用，羧基与极性氨基酸侧链结合。这两种暗示都增加了蛋白质表面足迹的局部浓度，从而提高了光标记效率。（2）CF3基团减少了重排反应，稳定了重氮中间体。同时碳稀蛋白质足迹法有几个特点：（1）碳稀插入到各种X-H键（即C-H，N-H，O-H，S-H），使试剂能够探测到蛋白质的许多暴露部位。（2）由于碳稀与水的快速反应，碳稀在水溶液中的寿命为纳秒，促使碳稀标记比蛋白质展开快。（3）另一方面，碳稀试剂的反应性依赖于蛋白质。
5. 蛋白质交联的应用
交联试剂包含两个或更多通过共价键在空间上束缚氨基酸残基的官能团。交联的目的是确定蛋白质复合物的拓扑结构并识别邻接区域。交联剂的长度是两个反应位点之间距离的空间约束，一些交联研究使用了多种连接剂。交联试剂的发展有两个主要趋势：（1）提高化学反应性，捕捉更多的氨基酸位点；（2）提高鉴定的可信度和灵敏度，以检测低丰度的交联产物。
含氟交联剂可以发挥作用，研究者开发了一种新的“标记和转移”方法，将甲硫基磺酸盐（MTS）基团和光活性二氮杂环（其中之一为TPD）并入异双功能光交联剂中。MTS组首先将一个半胱氨酸（Cys）引入“诱饵”蛋白中，然后用“诱饵”蛋白固定交联剂。随后的培养使目标蛋白形成复合物，然后在这两种蛋白质之间进行光化学交联。“诱饵”蛋白通过SDS-PAGE二硫键的还原而去除（图12）。
图12（a）MTS-二嗪啉和MTS-TFMD的结构。（b）交联工作流程示意图（c）UV-LED灯和定制丙烯酸芯片的图片。
6. 总结与展望
氟化学的振兴加强了我们对“F”如何深刻影响分子结构、反应性和功能的理解。这种复兴在材料、聚合物、农用化学品和医药领域结出硕果，毫无疑问，它将扩展到这些领域之外。在这里，我们描述了含氟试剂如何影响结构蛋白质组学，这是氟化学的一个新的前沿领域。我们确定了四个影响因素：（1）X-F键很强，这使含有X-F的试剂保持与生化实验相称的适当的水稳定性。蛋白质修饰必须在生理相关的条件下发生（通常<37⁰C，pH 6–8，在含有mM缓冲液和其他盐的水介质中）。（2）氟的存在可以提高标记效率。TPD和氟化叠氮化物的引入避免了侧重排。由于·CF3的金字塔化和强烈的σ-诱导效应，·CF3比其甲基自由基类似物更具反应性。（3）氟替代可以保持药物疗效。事实上，含有一种或多种氟的药物已经司空见惯了。含氟试剂的合成通常比非氟试剂的合成困难。试剂中氟化程度的增加通常会降低试剂在水环境中的溶解度。结构蛋白质组学的一个目标是确定活细胞中的内源性蛋白质结构。由于氟化试剂提高了细胞渗透性和代谢/蛋白水解稳定性，因此可以更好地作为体内蛋白质结构的检测试剂。