科研 | J Clin Invest：模拟Samd9 / 9L综合征的小鼠多器官衰竭伴受体代谢异常

编译：微科盟大陈子，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。

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导读

常染色体显性“不育α基序结构域包含9 (Samd9)和Samd9L (Samd9/ 9l)综合征”是目前遗传性较大的骨髓衰竭综合征亚群，包括幻影综合征、共济失调全血细胞减少症和家族单倍体7综合征。Samd9/9L基因串联位于7号染色体上，被认为是与7号单倍体相关的髓系恶性肿瘤基因。此外，作为干扰素诱导基因，Samd9/9L对保护病毒至关重要。Samd9/9L综合征是由功能获得突变引起的，并发展为与7号单倍体(MDS/-7)相关的婴儿骨髓增生异常综合征，发病率异常高。我们构建了表达Samd9L^D764N的小鼠，其模拟了出现生长迟缓、寿命短、骨髓衰竭和多器官退化的MIRAGE综合征。在造血细胞中，Samd9L^D764N减轻转铁蛋白和c-Kit的内吞作用，导致罕见的贫血和低骨髓重构潜能，最终导致单体7综合征（monosomy 7，MDS/-7）；而在非造血细胞中，Samd9L^D764N通过向细胞膜转移Ship2磷酸酶加速EGFR的内吞作用，并激活溶酶体，导致表面受体和信号转导的表达降低。因此，Samd9/9L是干扰素的下游调节剂，控制受体代谢，并且导致多器官功能障碍。

论文ID

原名：Multi-organ failure with abnormal receptor metabolism in mice mimicking Samd9/9L syndromes

译名：模拟Samd9 / 9L综合征的小鼠多器官衰竭伴受体代谢异常

期刊：Journal of Clinical Investigation

IF：11.864

发表时间：2021.02

通讯作者：Toshiya Inaba

通讯作者单位：日本广岛大学

实验设计

1. 利用CRISPR/Cas9技术构建携带Samd9L突变的小鼠以模拟MIRAGE综合症，并且对突变体小鼠的特性进行研究；

2. 采用干扰素诱导剂聚肌苷酸[Poly(I:C)]注射mice^-/-、mice^+/+、mice^m/m、mice^m/+以评估正常和突变的Samd9L对红细胞生成的影响；

3. 通过使用Ly5同源小鼠系统探究造血干细胞的骨髓重组潜能以及形成原因。

4. 建立的永生化肺成纤维细胞（LF）阐明Samd9L及其突变体对受体内化的调控机制。

实验结果

1. 携带Samd9L突变的小鼠模拟MIRAGE综合症

在Samd9/9L综合征患者的整个蛋白中，人们已经发现了大量Samd9/9L基因的错义突变(图1A)。我们选择了在MIRAGE综合征系谱的Samd9^D769N，其中2例患者发生了婴儿期MDS。由于此突变位点的侧翼区域在人Samd9和小鼠Samd9L以及许多其他哺乳动物的Samd9 / 9L蛋白之间是非常保守的(图1B)，因此我们推测，小鼠等效物Samd9L^D764N的作用与人Samd9^D769N相似(请注意，小鼠基因组没有Samd9基因)。

我们利用CRISPR/Cas9技术，通过核前注射Cas9蛋白和基因特异性引导RNA，在F2受精卵中靶向基因以获得D764N半合子(mice^m/+)。两名雄性Mouse^{m / +}原始代能够繁殖，并且通过测序检查了雌性杂合后代(图1C)；这些被用于该品系的进一步育种。当雄性和雌性mice^m/+小鼠交配时，虽然它们很活跃，但大约有四分之一的后代很小，其中三分之一死于断奶前。所有断奶后存活的小鼠随后均为D764N纯合子(mice^m/m;图1 D)。这些小鼠活动超过两个月，但在15周后开始死亡，大部分在28周内死亡(图1E)。为了构建Samd9L^m/-小鼠，我们将D764N半合子小鼠(mice^m/+)与Samd9L缺陷小鼠(mice^-/-)配对，这些小鼠经常自发发展成MDS，而Mice^m/+、Mice^m/-未见明显异常。

mice^m/m发展为贫血，这是Samd9/9L综合征和B淋巴细胞减少的常见症状，我们在一些MIRAGE综合征患者中也观察到这一症状(图1F)。15周大老鼠的胸腺看起来正常，但在20周时迅速萎缩。虽然10周大的雄性mice^m/m可以生育，但它们的睾丸随后迅速萎缩(图1G)。8周时肾脏苍白，随后发生囊变性(图1H)。这种严重的表型在MIRAGE综合征中尚未见报道，可能是因为小鼠肾脏表达的Samd9L在所有被测器官中最高，而人类肾脏表达的Samd9最低。而新生儿肾上腺功能不全是MIRAGE综合征的特征，而mice^m/m的肾上腺大小明显正常。

图1 表达Samd9L^D764N突变体小鼠的特性研究

(A)人Samd9/9L蛋白谱提示MIRAGE、ataxiapancytopenia ( AP )和其他Samd9 / 9L综合征成员的突变。(B)哺乳动物Samd9/9L突变位点周围氨基酸序列比对(红色)。Dots(.)表示与人类Samd9相同的氨基酸残基。(C) mice^m/+尾部DNA测序分析。(D)小鼠2周大时的照片。基因型如上图(左)所示。mice^+/+、mice^m/+、mice^m/m体重。平均值被绘制出来，误差显示SD。(E)出生后28天的生存曲线。显著性采用log-rank检验。(F) 25周龄外周血计数。水平线表示平均值，垂线表示标准差。每组8只。(G和H)福尔马林固定后附睾小鼠睾丸(G)和解剖后立即肾脏(H)的照片。基因型和年龄见图，D和F的* P < 0.05，* * P < 0.01 (Tukey Kramer检验)。

2.mice^m/m红细胞转铁蛋白受体的延迟内化

mice^m/m中发生的贫血为低色度和轻度小细胞性(图2A)。与Samd9/9L综合征患者不同，mice^m/+显示正常的红细胞指数。为了评估正常和突变的Samd9L对红细胞生成的影响，mice^-/-，mice^+/+，mice^m/m，和mice^m/+被注射干扰素诱导剂聚肌苷酸[Poly(I:C)]，因为Samd9L是一个干扰素诱导基因。每周注射两次Poly(I:C)，持续1个月，Samd9L蛋白在mice^+/+和mice^m/+的肾脏中表达增强(图2B)，尽管mice^m/m在几次注射后迅速恶化至死亡。在+/+小鼠中，我们观察到血红蛋白(Hb)和平均红细胞体积(MCV)迅速下降，而在mice^m/+中下降更严重，但在mice^-/-中没有(图2C)，这表明Samd9L的过度表达抑制了红细胞生成，并通过D764N突变增强了其作用。这些数据也强调了mice^m/+造血系统的脆弱性。

25周时，mice^m/m，和mice^m/+血清铁浓度正常，但血清促红细胞生成素(Epo)水平升高(图2D)，说明贫血不是由于肾衰竭引起的促红细胞生成素低。骨髓细胞是正常细胞(图2E，上图)，其原红细胞和嗜碱性红细胞比例增加(下图)，尽管小鼠之间存在显著差异，约有1/4的小鼠骨髓细胞数量减少。我们用抗转铁蛋白受体抗体的流式细胞术分析(FCM)；在Ter119阳性的红细胞和骨髓细胞和脾细胞的红细胞中均发现TfR高表达(图2F, 小图)。我们使用CD44抗体和细胞大小(正向散射)，进一步分离ter119阳性细胞(图2G，上面板)。实验结果显示，嗜碱性和多色红细胞^m/m中有高TfR表达(下图)。

这些数据表明，Samd9L^D764N在血清铁正常、促红细胞生成素浓度高和红细胞表面TfR高的情况下诱导了一种非常罕见的低色/小细胞贫血，它编码一种磷脂酰肌醇(PI)结合网格蛋白组装蛋白，该蛋白在网格蛋白介导的内吞作用(CME)过程中驱动包被的凹坑形成。缺乏Picalm的小鼠不仅表现出罕见的贫血类型，而且体形小，寿命短(类似于mice^m/m)，这表明Samd9L^D764N通过抑制Picalm功能来抑制铁的吸收。我们使用抗小鼠Samd9L的单克隆抗体（A6m）进行免疫荧光（IF）染色检测到Samd9L在来自mice^+/+（但不是来自mice^-/-）的Ter119阳性脾细胞中大量表达，这也显示了Picalm网格蛋白的高表达和TfR（补充图S1）。

由于Picm缺陷小鼠红细胞内吞转铁蛋白(Tf)和TfR的速度减慢，我们采用基于FCM的特异性杂交内化探针(SHIP)分析来测量稳态表面受体的内化率。正如之前报道的那样(图2H)，在红细胞中，Tf和TfR迅速内化^+/+，我们观察到类似的内化率^-/-。红细胞^m/m细胞内吞作用延迟，表明Samd9L^D764N是CME的抑制因子。

图2 EB^m/m中Tf/TfR内化率低

(A)红细胞指数。MCHC:平均红细胞血红蛋白浓度，MCH:平均红细胞血红蛋白，MCV:平均红细胞体积。(B-C) 8周大的小鼠，每周一次腹腔注射poly(I:C)，持续1个月。肾提取物的免疫印迹使用抗体在左边。相对于未治疗小鼠(Cnt)的表达水平显示在两组之间(B)。Hb和MCV.每组n=5 (C)。(D) 25周龄小鼠血清铁(高)或Epo(低)浓度。水平线表示平均值，垂线表示标准差。（E）石蜡切片H&E染色（上）和May-Giemsa染色的胞旋制备（下）来自10周龄mice^m/m的代表性骨髓。(F)使用TfR和Ter119抗体的5周龄小鼠骨髓(上)或脾细胞(下)的代表性FCM图(四个独立实验)。嵌合物：Ter119 -阳性红细胞和红细胞。(G) 5周龄小鼠骨髓细胞的代表性FCM图(三个独立实验)显示嗜碱性(BasoEB, II)、多色(PolyEB, III)和正色红细胞(OrthoEB, IV)，用CD44抗体对Ter119阳性细胞进行染色(图2F)和正向散射(上)。各部分TfR的代表性FCM直方图(下)。(H) 5周龄小鼠骨髓Ter119阳性红细胞中TfR(左)或Tf(右)内化的SHIP分析。给出了具有代表性的结果。在四个独立的实验中也得到了类似的结果。绘制均值，误差显示A、C、D的SD，* P < 0.05，* * P < 0.01 (C的Tukey检验，A、D的Tukey Kramer检验)。

3. 表达Samd9L^D764N的未成熟造血祖细胞的骨髓重构潜力低

接下来我们分析了造血干细胞(HSC)和造血干细胞/祖细胞(HSPC)。我们先前曾报道HSPC表达Samd9L转录本，以及c-Kit+Lineage(Lin)-Sca-1+(KLS)组分[长 (LT)-HSC,CD34-flt3-；短(ST)-HSC, CD34+flt3-;多能祖细胞(MPP)，CD34+flt3+]]在mice^+/+和mice^-/-之间没有改变。我们在mice^+/+、mice^m/+和mice^m/m之间未观察到HSC总数和比例的差异(图3A)；然而，与mice^m/+或mice^+/+相比，mice^m/m组中红细胞祖细胞的数量减少，我们也观察到谱系相关前体的显著差异(图3B)；尽管血清Epo水平较高(图2D)，这表明mice^m/m小鼠骨髓细胞对Epo的反应降低。为了验证这一点，我们从mice^+/+、mice^m/+和mice^m/m中分离出的c-Kit+Lin-(KL)细胞在含Epo的培养基中培养3天，产生成熟的红细胞。培养分离的KLm/m细胞生成成熟红细胞的效率低于KL^+/+或KL^m/+细胞(图3C)。KL^m/m细胞的生长和活力显著下调(图3D)，显示KLm/m细胞对Epo的反应较差。

然后我们测试了对干细胞因子(SCF)和血小板生成素(TPO)的反应。我们将mice^+/+、mice^m/+或mice^m/m骨髓细胞在含SCF和TPO的培养基中培养5天，然后分离KL细胞(KL-5d^+/+、KL-5d^m/+、KL-5d^m/m)，继续培养5天。KL-5d^m/m细胞比KL-5d^+/+细胞生长缓慢(图3E，顶部)，暗示对mice^m/m中HSPC的SCF/TPO敏感性较低。然后我们应用SHIP分析检测c-Kit在KL-5d细胞中的内吞作用，与对照组KL-5d^+/+细胞相比，在KL5d^m/m细胞中c-Kit的内吞速度较慢，但在KL5d^m/+细胞中却没有(图3E，底部)。

Samd9/9L综合征患者的一个显著特征是伴有-7/del(7q)的MDS的频繁发展，其中突变的Samd9/9L丢失；然而，mice^m/+或mice^m/m在他们的一生中没有表现出任何髓系恶性肿瘤的迹象。我们用间期荧光原位杂交(FISH)分析方法测量了老龄小鼠(>24周)骨髓中携带Samd9L基因缺失细胞的频率。与mice^+/+相比，mice^m/+或mice^m/m的骨髓系、红细胞系或淋巴系骨髓细胞中携带Samd9L基因缺失的细胞频率并未增加(补充图S2)。

最后，我们通过使用Ly5同源小鼠系统进行骨髓竞争再聚试验，分析了造血干细胞的骨髓重组潜能。照射过的Ly5.1小鼠移植了来自Ly5.2 mice^m/m、Ly5.2 mice^m/+或Ly5.2 mice^+/+的LT-HSC组分以及来自Ly5.1mice^+/+的骨髓细胞。相对于HSC^+/+，HSC^m/m的电位显著降低(图3F)。出乎意料的是，与HSC^+/+相比，HSC^m/+也显著降低。这些发现与我们之前发表的结果形成鲜明对比，我们的结果显示，与HSC^+/+相比，HSC^-/-和HSC_+/-具有更高的重构潜能。

HSC^m/m和HSC^m/+的低骨髓重构电位可能是由于低内吞作用导致细胞表面持续c-Kit增加了自我更新的可能性。为了验证这种可能性，我们分析了HSC (Ly5.2)移植三个月后受体小鼠(Ly5.1)的骨髓，观察到LT-HSC^m/m非常低，LT-HSC^m/+显著减少(图3G)；表达Samd9L^D764N的Ly5.2细胞在ST-HSC和MPP中部分恢复，表明在竞争性骨髓环境中，表达Samd9L^D764N的LT-HSC被HSC^+/+抑制。

综上所述，Samd9L^D764N降低造血细胞表面受体TfR和c-Kit的内吞，导致mice^m/m细胞贫血。mice^m/+表现为正常外周血及骨髓指标，而HSPC^m/+表现为隐性低功能，如干扰素引起的贫血更严重，骨髓重建潜能更低。 

图3 造血祖细胞的特性

(A)c-Kit+Lineage (Lin)-Sca-1+ (KLS) 群体的细胞数量[长(LT)-HSC,CD34-flt3-；短(ST)-HSC, CD34+flt3-; 多能祖细胞(MPP), CD34+flt3+]。(B)Lin/Sca-1/IL-7Ra-c-Kit+人群中祖细胞的百分比。bipotent pre-megakaryocytic (Mk)/erythroid(E) progenitors (PreMegE)；Mk progenitors (MkP)；pre-colony formingunits-E (Pre CFU-E)；pre-granulocyte macrophage (GM)progenitors (PreGM)；GM progenitors (GMP).5只小鼠的均值和SD。(C-D) KL细胞在Epo中培养3天。培养第3天，成熟红细胞(FSClow, SSClow)的数量(C)。用台虫蓝染料排除法测定培养过程中活细胞数量和死亡细胞百分比(D)。8周龄5只小鼠的平均值和SD。(E) mice^+/+或mice^m/m的骨髓细胞含mSCF和血小板生成素培养5天。5只9周龄小鼠的平均值和SD。(F和G)重组电位使用Ly5同源小鼠系统和从9周龄小鼠分离的LT-HSC细胞。供者来源( Ly5.2 + )细胞占移植后所指时期外周血白细胞总数的百分比。绘制均值，误差显示SD ( F )，移植后3个月受体小鼠骨髓LT- HSC、ST- HSC、MPP和Lin阴性细胞Ly5.2阳性细胞比例。5只小鼠的均值和SD ( G ) . * P < 0.05，* * P < 0.01 (B-E和G的Tukey试验，F的Tukey Kramer试验)。

4. EGFR在睾丸^m/m和肾^m/m中的表达降低

6周大的小鼠睾丸表现出发育良好的精小管(图4A)；然而，间隙中含有少量嗜酸的间质细胞(LC)，导致血清睾酮水平低(图4B)。14周龄小鼠睾丸^m/m显示严重萎缩(图4A)。免疫组织化学石蜡包埋切片(IHC-p)显示在LC中高表达Samd9L，这与之前报道的在人类LC中高表达Samd9一致。我们发现EGFR在睾丸^-/-和其他细胞中高表达，而在LC^m/m中低表达(图4C)。

6周大的肾脏m/m表现出明显的正常结构(图4D)。12周时可见增大的鲍曼囊和近端肾小管，25周时可见大囊肿破坏肾脏结构。IHC-p显示Samd9L在肾脏^+/+中大量表达，外皮层区肾小管上皮细胞(RTE)表达最高(图4E)。此外，Samd9L^D764N在肾脏边缘的表达解释了mice^m/-和mice^m/+表型的缺乏。

肾^+/+RTE中，表皮生长因子受体(EGFR)在被膜下层表达最多 (图4F)，也大量表达Samd9L(图4E)。而在肾^-/-中，EGFR表达进一步增强，而在肾^m/m中被抑制，暗示Samd9L下调了EGFR表达。如果Samd9L作为受体表达水平的“限制因子”发挥作用，就可以理解这种有点矛盾的观察结果。

图4 EGFR在睾丸^m/m和肾^m/m中的表达降低

(A和D)睾丸(A)或肾脏(D)的H&E染色。图表显示了年龄和基因型。( B ) 14周龄mice^+/+血清睾酮浓度 ( n = 6 )或mice^m/m( n = 4 )于下午3：00测定，昼夜节律高峰时间。水平直线表示均值，垂直SD . * P < 0.01 (双侧学生t检验)。(C, E, F) 6周龄小鼠睾丸(C)或肾脏(E和F)的IHC-p染色，使用左侧显示的抗体和苏木精反染。

5. Samd9L及其突变体对受体内化的负调控

为了阐明Samd9L^D764N下调EGFR的机制，我们分析了从高水平表达Samd9L(在LF^+/+和LF^m/m中)和EGFR的mice^+/+、mice^-/-和mice^m/m+中建立的永生化肺成纤维细胞（LF）（图5A）。在LF^m/m中，Samd9L蛋白相对于LF^+/+的表达水平(0.32±0.08)低于mRNA水平(0.73±0.07，实时荧光定量PCR检测)，表明Samd9L^D764N具有不稳定性。有趣的是，当LF在无血清/细胞因子培养基中培养时，与LF^+/+或LF^-/-相比，LF^m/m的表面EGFR表达水平较低(图5B)。此外，在LF^m/m中，EGF刺激后Akt磷酸化的时间比LF^+/+短(图5C)。相比之下，LF^-/-的激活时间更长，这与我们之前发表的PDGF研究结果一致。因此，在这些永生化的LF中，EGFR代谢和信号转导的调节至少部分得以保留，尽管LF以细胞因子独立的方式生长。

当血清/无细胞因子培养基中LF^+/+或LF^-/-维持时，用EGF刺激，2分钟后EGFR定位不变(图5D)；然而，我们在大于30分钟检测到代表早期核内体表皮生长因子受体的斑点蛋白。相比之下，LF^m/m的表面EGFR信号在2分钟内明显减少，10分钟内几乎无法检测到斑点，暗示配体结合的EGFR快速内吞，溶酶体降解。然后，我们将SHIP分析应用于无血清/细胞因子培养的LF，以测量稳态和配体独立的EGFR内化率。LF^+/+和LF^-/-在5分钟内内化率约为30%(图5E)，远低于配体结合的EGFR内吞(5分钟时几乎为100%，图5D)。LF^m/m中配体未结合的EGFR的内化速度比LF^+/+或LF^-/-快(图5E)。我们重点研究了含sh2的5'肌醇磷酸酶2 (Ship2)，它可以催化PI-3,4,5-三磷酸转化为PI-3,4-二磷酸，从而促进细胞内吞。 

图5 EGFR在永生化LF^m/m中的快速代谢

(A)用Samd9L(上)、EGFR(中)或β-actin(下)抗体对LF提取物进行免疫印迹分析。上述为Samd9L基因型。说明了Samd9L或EGFR蛋白与β-actin的相对表达比。(B) LF表面EGFR表达的代表性FCM直方图(三个独立实验)。(C和D) LF在含EGF (50 ng/mL)的培养基中培养。免疫印迹检测使用的抗体显示在左边。各组之间显示磷酸化Akt (pAkt)与总Akt (Akt)的相对表达比例(C)。IF染色使用EGFR抗体。核用DAPI染色。 (E)SHIP分析，测量在无血清/细胞因子培养基中培养的LF中EGFR的内在化。平均值被绘制出来，误差显示了标准偏差。* P < 0.05，* * P < 0.01(Tukey试验)。

6. Samd9L^D764N诱导Ship2转运

我们试图通过寻找LF^m/m中表达改变或细胞内定位改变的蛋白来确定Samd9L^D764N介导的EGFR内吞上调的相关因素。先前的报道表明，Ship2在血清或细胞因子刺激下从核周区转移到细胞的周围，这在LF^+/+中也有体现。在EGF刺激后2分钟内，显示“核周Ship2定位”的细胞数量减少，而显示“弥漫Ship2定位”(定义见附图S3中的图例)的细胞数量增加(图6A和6B)。然而这种易位在LF^-/-中被延迟，LF^m/m在缺乏血清/细胞因子的情况下表现为弥漫Ship2定位(图6A和6B)。此外，在无血清/细胞因子培养基中，RTE^+/+原代培养显示Ship2在核周定位，但在应力纤维和板状伪足外荧光信号很少(图6C，图1)；EGF刺激导致Ship2在2分钟内转移到RTE^+/+表面(图2，箭头)。相比之下，在EGF缺失或存在时，大量Ship2局限于RTE^m/m的板状伪足(面板3和4)。

然后我们观察了极化RTE中Ship2的定位。肾脏IHC-p染色显示，大多数Ship2蛋白存在于RTE^+/+和RTE^-/-的顶端区域(刷状缘)，与高碘酸希夫(PAS)染色重叠(图6D)，在EGFR存在的基底区域仅可见微弱的条纹染色(箭头)(图4F)。相反，我们在RTE^m/m基底区观察到密集染色(箭头所示)，Ship2的分布改变。这些发现得到了IF的支持：尽管定位于刷状缘的Ship2蛋白显示出微弱的染色，可能是由于固定程序的差异（图6E），但在肾^m/m中，靠近横向基底肌动蛋白束（菱形）的Ship2信号（箭头）明显增强。

通过Samd9L抗体对RTE提取物免疫沉淀产物进行免疫印迹分析，我们发现Ship2与Samd9L存在关联(图6F)。尽管这两种蛋白质的共定位在传统的IF染色中没有明确显示(数据未显示)，但高度敏感的Duolink原位邻近连接分析(D-PLA)显示内源性Ship2与LF^+/+或LF^m/m中的Samd9L或Samd9L^D764N之间分别存在相互作用(图6G)。我们还在活的293T细胞中使用荧光技术检测蛋白-蛋白相互作用(Fluoppi)。在本试验中，当没有结合伴侣标记的组装辅助（Ash）共表达时，Azami Green（AG）蛋白表现出弥漫分布（图6H，面板1），如表达AG载体和Ash-tag载体的阴性对照细胞所示。AG-hSamd9L融合蛋白的瞬时表达在与Ash-tag载体共表达时也在细胞质中产生弥漫绿色荧光(面板2)。通过AGhSamd9L融合蛋白与Ash标记的Ship2蛋白共表达，我们发现在Ship2定位的核周区域出现斑点(面板3)，表明在本实验系统中hSamd9L与Ship2相互作用。 

图6 Samd9L^D764N改变Ship2的胞内定位

(A至C) LF (A)或维持在无血清/细胞因子培养基中的1周龄小鼠RTE原代培养物(C)在含EGF (50ng /mL)或IFNγ (1ng /mL)的培养基中培养。用所示抗体和phalloidin对细胞进行F-actin染色。箭头：A中显示“弥散Ship2定位”的细胞，C中显示lamellipodia .显示“弥散Ship2定位”的细胞比例。计数200个细胞. * * P < 0.01 (卡方检验) ( B )。(D和E)使用Ship2抗体与periodic acid-Schiff染色(PAS)和苏木精反染进行IHC-p染色(D)，对6周小鼠肾脏的冷冻切片(E)进行IF染色。插入图(上部)进一步放大，箭头突出了Ship2的条纹定位，箭头密集了基本区域的Ship2信号。 (F) RTEs细胞提取物的免疫印迹(IB)(输入)。免疫前血清或Samd9L抗体免疫沉淀产物(IP)的IB。使用IB分析的抗体显示在右边。三个独立实验的代表性数据。(G)用Samd9L (A6m)和Ship2抗体作为一抗进行LF的D-PLA检测。(H) 293T细胞Fluoppi检测。Azami-green (AG)和Hoechst 33342染色的核(蓝色)合并。细胞核A、C、E、G染色为DAPI染色，H染色为Hoechst 33342染色。

7. Samd9L^D764N和干扰素激活溶酶体

LF^m/m中EGFR信号的快速消失(图5D)暗示了溶酶体激活。在无血清/细胞因子培养基中培养时，溶酶体相关膜蛋白1 (Lamp1)的免疫染色在LF^+/+或LF^-/-中产生少量的Lamp1信号，而在LF^m/m中信号明显增强(图7A，左面板;图7D)。因为免疫印迹分析显示，总Lamp1蛋白水平在LF细胞系中保持相对不变(图7C;由于糖基化严重，Lamp1条带看起来模糊)，所以增强信号可能是由于Lamp1在溶酶体中的集中引起的。此外，Samd9L^D764N和人的AP综合征致病突变Samd9L^H880Q在HEK293细胞中的强制表达显著增加了Lamp1信号(图7D和7E)。

肾脏IHC-p显示Lamp1弥漫性分布，在RTE^+/+的根尖区染色密集，而信号严格限制在RTE^-/-的根尖区(图7F，上表)；相比之下，RTE^m/m基底区信号致密。冷冻切片IHC (IHC-f)证实了这些结果(下图)，显示在RTE^m/m基底区EGFR与Lamp1信号明显重叠(箭头)。

由于Samd9/9L是干扰素(IFN)应答基因，Ship2易位和溶酶体激活可能是干扰素的功能。为了验证这一点，我们将LF^+/+和LF^m/m在含IFNg的培养基中培养48 h。正常和突变的Samd9L分别在LF^+/+和LF^m/m中表达增强(图7G)。在LF^+/+中，呈弥漫Ship2定位的细胞数量增加(图6A右面板，图6B)。我们在LF^+/+中观察到轻度增强的Lamp1信号(图7A，右图；图7B)和减少的表面EGFR表达(图7H)。在LF^m/m中，Ship2的分布(图6A和6B)和表面EGFR表达(数据未显示)没有显著改变;然而，我们观察到Lamp1信号明显增强(图7A和7B)。这些数据表明Samd9L作为IFNg的下游调节因子在病毒防御机制中发挥作用。g/f突变的组成性上调可能损害高表达Samd9L的器官。

图7 Samd9L^D764N在干扰素的控制下易位Ship2并激活溶酶体

(A和B)在血清/无细胞因子培养基(左图)或含有IFNγ(1ng/mL)的培养基中培养的LF用Lamp1和EGFR抗体染色(A)。Lamp1信号面积的量化(红色)>EGFR(绿色)采用补充图S3 (B)图例中描述的方法。(C)免疫印迹法检测左表所示的抗体。(D和E)用含有Samd9L cDNA的pCMV3表达载体瞬时转染293细胞。细胞用Lamp1抗体染色(D)。由ImageJ软件确定的红色信号阳性像素数除以细胞核数(E)。(F)使用左列抗体对6周龄小鼠肾脏进行苏木精抗染IHC-p(上)和IHC-f(下)。以箭头表示EGFR和Lamp1信号的重叠。(G) LF^+/+或LF^m/m与以上浓度的IFNγ一起培养48 h。用左图所示的抗体对提取物进行免疫印迹分析。Samd9L与bactin的相对表达比显示在两个面板之间。三个独立实验的代表性数据。(H)用IFNγ(1和5 ng/mL)培养LF 48 h。表面EGFR表达的代表性FCM直方图(三个独立实验)。核用DAPI染色。

讨论

在多器官变性患者中发现的Samd9/9L突变表明，这种突变所获得的功能损害了细胞生长、生存和分化的基本系统。我们在mice^m/m与Picalm缺陷小鼠的相似性中发现了这一概念的线索。由于Tf-TfR内化减少，两组小鼠都发生了一种罕见类型的贫血，与红细胞表达高表面TfR相关(图2H)，表明Samd9L^D764N损害了网格蛋白介导的内吞作用；此外，c-Kit也在HSPC^m/m中缓慢内化(图3E)。

与造血细胞不同，Samd9L^D764N通过Ship2转运到细胞外周，在LF^m/m中上调配体结合或非结合EGFR的内吞噬(图5D和5E)(图6A和6B)。这种差异可能是由另一种Ship1(PI -3,4,5-三磷酸磷酸酶)在造血细胞中的表达引起的。因为血液学紊乱发生在Ship1-而不是Ship2-缺陷小鼠中，Ship2不太可能在造血细胞中起主导作用。这两种磷酸酶的不同之处在于在Ship2的c端存在一个无菌α基序(SAM)结构域，但在其他地方有共同的基序和结构域。由于SAM结构域是一种蛋白质相互作用模块，存在于多种参与许多生物过程的蛋白质中，我们研究了Samd9/9L是否通过它们的SAM结构域与Ship2结合。SAM域对相互作用的作用尚未明确说明(数据未显示)，这意味着详细的分子机制仍有待澄清。

表皮生长因子受体( EGFR )在小鼠睾丸间质细胞( LC )中的低表达(图4C )会损害LC的增殖和类固醇生成，或影响青春期LC的干细胞和祖细胞的发育；尽管其他生长因子，如PDGF或成纤维细胞生长因子对LC的发育和功能已有相关报道。此外，由于EGFR缺陷小鼠表现早产或围产儿死亡，并且有文献报道EGFR衍生信号对维持肾脏完整性的作用。EGFR的低表达很可能是内吞作用和溶酶体活性增强的联合作用，这是受体酪氨酸激酶的一种常见的调节机制。因此，减少表皮生长因子和其他生长因子的表面受体将损害mice^m/m和/或Samd9/9L综合征患者的多个器官，并且高水平表达Samd9L。

与LF^m/m增强的EGFR内吞相比，HSPC^m/m显示c-Kit内吞减少，对SCF的反应较低(图3E)。这可能会诱导表面c-Kit的高表达，如红细胞^m/m中的高TfR表达(图2F)。遗憾的是，研究人员在技术上难以测量HSPC中c- Kit的表面表达水平，因为c- Kit抗体本身需要将HSPC与多种表达水平的c- Kit表达细胞区分开来。在骨髓中，来自不同血统和/或需要相同细胞因子的成熟阶段的细胞彼此相邻。我们最近证明，在用可渗透IL-3但限制细胞转移的膜片与鼠IL-3依赖细胞共培养的过程中，IL-3R快速内化的细胞或表面IL-3R较低的细胞可通过从后者“窃取”IL-3，相比内吞较慢的细胞或表面受体较高的细胞，获得了生长优势。因此，快速内化在骨髓中显得至关重要。

与Samd9/9L综合征不同，出生后的mice^m/+成熟正常，外周血指标正常；此外，HSPC^m/+与HSPC^+/+的数量和体外生长潜力没有显著差异(图3A- 3E)。我们认为，人类和小鼠之间的这种差异是由于携带该突变的小鼠中Samd9L^D764N的表达水平相对较低，通常表现在肾脏(图4E)，在小鼠各器官中Samd9L的表达水平最高。实际上，通过Poly（I:C）诱导正常和突变的Samd9L比在mice^+/+中更深地降低了mice^m/+中的Hb浓度，而在mice^-/-中几乎没有观察到降低（图2C）。mice^m/m中还显示了表达水平依赖性症状，因为Poly（I:C）I.p.注射导致mice^m/m的全身状况迅速恶化，类似于Samd9/9L综合征患者，后者在病毒感染后经常经历此类发作。在这方面，特定的无病原体的小鼠很少有机会感染病毒，这可能解释了与人类相比mice^m/m(伴有孤立性贫血和b淋巴细胞减少症的正常细胞骨髓)相对轻微的骨髓表现。HSC^m/+的骨髓重构电位较低(图3F)似乎与mice^m/+的正常外周血和骨髓指数不一致。小鼠及人同种异体骨髓移植过程中IFNg的升高将是造成这种差异的原因：HSC^m/+及具有降低的表面受体内化的HSC^m/m在骨髓生长竞争中被HSC^+/+所压倒。我们以前曾报道HSC^+/-的骨髓重建潜力超过了HSC^+/+，因此，我们认为，反复病毒感染在Samd9/9L综合征患者中诱导的IFNγ不仅恶化了骨髓衰竭，而且扩大了已有的丢失了突变Samd9/9L基因的-7/del(7q)克隆。

结论

该小鼠模型系统为Samd9/9L综合征的发病机制提供了一种场景，其中突变的Samd9L导致多器官功能衰竭;然而，相关发现之间因果关系的证据大多是间接的。为了从这个推测性的模型建立一个牢固的Samd9/9L综合征理论，阐明相关分子机制是至关重要的。Samd9L^D764N影响表面受体的内化率，增强溶酶体活性；然而，通过对Samd9L缺陷小鼠及其衍生细胞的分析，我们发现早期核内体的同型融合下调，导致溶酶体中PDGFR的降解延迟，而共同的分子机制可能是Samd9/9L调控这三个步骤中的每一个:受体的内吞、内吞体的同型融合和溶酶体激活。Samd9/9L综合征研究的一个重要方向是建立一种新的小鼠模型，该模型携带一条人工染色体，包含整个Samd9和Samd9L基因的人类基因组，以减少由于小鼠基因组中缺乏Samd9基因而导致的物种差异。

原文链接：

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33373325/