科研 | 加利福尼亚大学：Micro-144沉默可以防止雄性小鼠的动脉粥样硬化，但对雌性小鼠则无预防作用
编译：KT!，编辑：十九、江舜尧。
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在发展中国家，动脉粥样硬化是死亡的主要原因。MicroRNA是一种基因表达的微调器，在动脉粥样硬化的病理生理和进展中具有重要作用。本文的研究者以及其它研究者先前已经证实microRNA-144 (miR-144)在转录后水平调控ABCA1 (ATP binding cassette transporter A1)和血浆HDL（高密度脂蛋白胆固醇）的水平。这篇研究中，研究者探索了miR-144是如何预防动脉粥样硬化的。
研究证明了miR-144的沉默降低了雄性低密度脂蛋白受体缺如（Ldlr−/−）小鼠的动脉粥样硬化，而在雌性小鼠中并无该作用。沉默MiR-144升高了循环中HDL的水平，重塑了HDL颗粒，增强了胆固醇逆向转运（RCT）。重要的是，HDL升高和逆向胆固醇转运增强的效应在雄性小鼠中更为显著，这说明，MiR-144在动脉粥样硬化中的沉默效应可能具有性别特异性。在分子机制上，研究者发现氧固醇代谢酶CYP7B1（细胞色素P450酶7B1）是miR-144在雄性小鼠中的调控基因，但非雌性小鼠的调控基因。研究者也发现在雄性小鼠中27-羟基胆固醇水平下降，这是一种致粥样硬化的固醇类物质，是雄性小鼠CYP7B1的内源性底物，但雌性小鼠中未发现这种现象。因此，研究证明miR-144的沉默效应表现出性别差异性，此外，研究也证明了靶向miR-144的反义寡核苷酸将增强心血管疾病患者的逆向胆固醇运输和氧固醇代谢。（见模式图）
论文ID
原名：MicroRNA-144 Silencing Protects Against Atherosclerosis in Male, but Not Female Mice
译名：Micro-144沉默可以防止雄性小鼠的动脉粥样硬化，但对雌性小鼠则无预防作用
期刊：Arterioscler Thromb Vasc Biol
发表时间：2020.02
影响因子：6.618（2018年）
通讯作者：Elizabeth J. Tarling
通讯作者单位：加利福尼亚大学洛杉矶分校心脏内科，医学系（UCLA Division of Cardiology, Department of Medicine）
DOI号：10.1161/ATVBAHA.119.313633
模式图
背景介绍
研究者本人以及其它同领域研究者已经证实了miR-144在转录后水平靶向ABCA1发挥作用。研究者认为miR-144是一种在肝细胞中由胆汁酸受体FXR诱导的miR，能够降低ABCA1蛋白水平和活性，并能在体外降低血浆HDL水平，减少原代鼠源肝细胞中胆固醇外流形成ApoA1。此外，Ramirez等人则认为MiR-144是一种在巨噬细胞中由肝X受体（Liver X recepter LXR）-诱导的MiR，过表达miR-144或者沉默将会在体外Huh7和J774细胞中减弱或者增强胆固醇向外周导向形成ApoA1的能力。ABCA1在肝细胞中HDL前体即前-β-HDL的产生和胆固醇从固醇负荷吞噬细胞中外流方面发挥重要作用。吞噬细胞表达清道夫受体，促进氧化/修饰的富胆固醇的低密度脂蛋白的摄取。接下来吞噬细胞通过2种固醇转运体ABCA1和ABCG1介导胆固醇导向外周以阻止泡沫细胞形成。Hu等人在近期一项研究中使用激动剂过表达miR-144后发现miR-144的升高减少了吞噬细胞中ABCA1的水平和体外胆固醇的外流。与这些结果相一致的是，对Apoe-/-小鼠使用miR-144激动剂治疗导致血浆中HDL水平的下降和逆向胆固醇转运的减少，加速了动脉粥样硬化的进程。
基于先前这些研究，研究者推测由于LXR激动剂浓度的升高诱导的吞噬型泡沫细胞中miR-144水平的升高可能通过限制ABCA1的活动从而限制了吞噬细胞中胆固醇的外流能力。研究者也假设长期对miR-144的沉默将导致肝细胞ABCA1蛋白表达的升高和血浆中HDL水平的升高以及逆向胆固醇转运能力的增强。这些变化可能加速先前存在的动脉粥样硬化病变的退化，改善疾病的进展。重要的是，目前尚无使用寡聚核苷酸沉默miR-144的在体的动脉粥样硬化的研究。
在这篇研究中，研究者证明了在Ldlr-/-小鼠中沉默miR-144,会导致雄性动脉粥样硬化面积的缩小，而非雌性。miR-144的拮抗剂可以升高循环中HDL水平，重塑HDL颗粒，增强RCT。这些现象不会出现在雌性身上，说明了性别特异性的差异。沉默MiR-144引起雄性小鼠CYP7B1的水平升高，同时伴随促粥样硬化的物质27-羟基胆固醇水平的下降，在雌性小鼠中，肝脏CYP7B1mRNA水平低了4倍，而且不受miR-144沉默的影响。
结果
1.慢性长期miR-144的沉默效应改善了动脉粥样硬化的进展
研究者在体内实验中已经证实2′-F/MOE anti–miR-144可以导致miR-144的沉默。接下来，研究者建立Ldlr-/-动脉粥样硬化模型（每个组10只小鼠，西方饮食16周），建模成功后分组，安慰剂组（PBS）、anti-miR对照组、anti-miR-144组（Figure 1A）。结果发现，anti-miR-144确实导致了miR-144的沉默（Figure 1B），但是对于小鼠体重和血浆中总胆固醇水平、肝脏Abca1 的mRNA水平、AST和ALT水平并无显著影响，但是另一个靶点Nfe2l2 和Rarb的mRNA水平显著升高(Figure IC 在线数据补充)。而使用anti-miR-144后ABCA1的蛋白水平显著升高 (Figure 1C)，血浆中HDL胆固醇水平也升高了20%(Figure 1D)，病变面积下降了35% (Figure1E和1F)。主动脉根部Oil red O染色也证明anti-miR-144处理组减少了动脉粥样硬化面积和脂质聚集（Figure1G和1H）。根据以上数据，研究者证明了miR-144的拮抗剂可以防止发生动脉粥样硬化。
图1. anti-miR-144处理改善了动脉粥样硬化进展
2.miR-144的急性抑制作用减轻了动脉粥样硬化
心血管疾病是导致死亡的主要原因，患者常常表现为动脉粥样硬化性疾病。临床上能够逆转疾病、阻止进一步发展的治疗策略是研究热点。因此，研究者设计了一种更接近临床的动脉粥样硬化模型。雄性Ldlr−/− 小鼠 (n=12-14 只/组)，西方饮食喂养16周形成动脉粥样硬化病变。之后，其中一组小鼠安乐死(Figure 2A; 基线)。剩下的小鼠转为饲料饮食减轻进一步进展，接下来，分成3组，分别为安慰剂组，anti-miR对照组，anti–miR-144组，共干预4周(Figure 2A)。结果显示，anti–miR-144干预组有效降低了miR-144水平(Figure 2B)，但对体重、血浆总胆固醇、肝脏Abca1 mRNA 水平、以及血浆AST/ALT 水平无显著影响。 而ABCA1蛋白水平和血浆HDL 胆固醇水平升高了45% 和15%（Figure 2C and 2D), 说明MiR-144的有效的基因沉默效应。anti–miR-144缩小了35%的病变面积，显著降低了动脉粥样硬化 (Figure 2E)。同时也如期望的结果，在饲料饮食后动脉粥样硬化未见进展(Figure 2E)。油红染色主动脉根部病变也发现anti–miR-144降低了病变面积（Figure 2F and 2G)。
晚期动脉粥样硬化病变中死亡细胞数增多，调亡细胞缺乏吞噬清除能力是坏死核心形成的主要原因。研究者通过测定caspase 3活化后的cleaved caspase 3来评估凋亡率。结果显示，anti–miR-144干预组凋亡细胞更少(Figure 2F and 2H). 为了证明这种凋亡率的降低是否与细胞清除作用有关，研究者设计了标准实验，将病变中凋亡细胞（cleaved caspase 3）和吞噬细胞共染色 (Mac3) ，接下来定量分析凋亡细胞 (cleaved caspase 3-阳性)，如果与吞噬细胞有关，说明凋亡细胞与吞噬清除作用相关。数据以相关/不相关的凋亡细胞的比值来显示，比值升高表示吞噬清除作用增强。研究者发现在anti– miR-144干预组病变中的吞噬清除作用更强(Figure 2I), 说明病变面积小以及凋亡率降低的机制之一是吞噬清除作用的增强。 此外，在anti–miR-144干预组可以检测到主动脉组织中CD68的大量表达，说明吞噬细胞在其中的浸润（Figure IIF 在线数据补充)。 处于稳态的M2型吞噬细胞的标志物Arg1, Cd206, 和Il10，其mRNA的表达水平显著升高(Figure IIG在线数据补充), 而M1 型吞噬细胞的标志物Il1b, Il6, 和Tnfa 的mRNA水平降低(Figure IIH 在线数据补充)，说明浸润的吞噬细胞类型主要为M2型细胞。此外，2′-F/MOE anti-miR 可以到达除了肝脏之外的其它组织，比如主动脉中。因此，研究者分析了miR-144 在小鼠主动脉组织的表达，发现anti–miR-144干预在主动脉组织中表现出显著的沉默效应 (Figure III 在线数据补充). 综上，研究者证明了anti–miR-144不仅靶向于肝组织，同时也靶向粥样斑块中的巨噬细胞。Anti-miR-144干预后导致主动脉组织中抗炎性吞噬细胞的大量聚集，伴随吞噬清除能力的增强，这可能是改善粥样硬化的的原因。为了进一步阐明miR-144 水平在人类动脉粥样硬化斑块中是否不同，研究者检测了患有颈动脉粥样硬化患者斑块中的miR-144水平并和对照动脉组织作比较 (Figure 2J). 最后发现miR-144在人类粥样斑块中的水平也是升高的，其中泡沫细胞也增多，LXR 受体素水平升高。MiR-144在人类无症状性颈动脉斑块中较症状性颈动脉斑块中的水平更低 (Figure 2K), 说明降低的miR-144水平与斑块的不同重构相关。
图2. anti–miR-144处理促进了动脉粥样硬化的退化
3.体内沉默miR-144增强了RCT，重塑了 HDL颗粒
图1和图2的数据说明沉默miR-144 在高胆固醇性Ldlr−/−小鼠中具有抗动脉粥样硬化的作用。Hu等人说明了使用激动剂过表达miR-144使之超过生理水平，会降低25%的血浆HDL胆固醇水平，并降低胆固醇向外周导向作用，其中向血液中的导向作用降低了15%，向肝脏中的25%，向粪便的20%。 但是，目前尚无研究采用拮抗剂降低miR-144 的表达来观察体内胆固醇的外周导向作用的变化情况。为了确定anti-miR-144处理高胆固醇性Ldlr−/−小鼠后升高的HDL水平是否导致了RCT的增强，研究者设计了体内RCT实验(Figure 3A). anti– miR-144处理的小鼠其胆固醇向血浆中导向的作用增加了30% (Figure 3B), 肝脏80%（Figure 3C), 粪便 50%（Figure 3D)。这个试验的理论基础是3H-cholesterol在胆固醇负荷的野生型巨噬细胞中的运动，而且这种功能不受anti– miR-144处理的影响。为了验证anti–miR-144处理后HDL颗粒是否增强了胆固醇外流能力，研究者又设计了体外HDL胆固醇外流能力的功能性实验， 使用放射性同位素标记的J774 巨噬细胞(Figure 3E) 或者 BHK 细胞过表达诱导型ABCA1 (Figure 3F) 或者 ABCG1 (Figure 3G)。从干预处理的小鼠中提取HDL，发现与未处理的小鼠相比，沉默miR-144后，胆固醇外流能力显著升高 (Figure 3E-3G)。 此外，胆固醇外流能力与血浆HDL胆固醇浓度相关(Figure 3H; r=0.43, P=0.03),这与经过处理后的HDL水平升高的结果相一致。
图3. anti–miR-144处理增加了胆固醇逆向转运和HDL外流能力
为了确定anti-miR144处理是否影响了HDL颗粒的成分，研究者对干预处理的小鼠提取的HDL进行了无偏移质谱分析(Figure 4A).通过图谱计数来识别差异表达的蛋白。ApoA1 是HDL的主要成分，未受到miR144的影响(Figure 4A and 4B)。此外，在干预处理的小鼠的HDL中共识别出7种差异表达的蛋白(Figure 4A-4D)，APOA2, MUP2 (主要尿蛋白), MUP6, MUP20, 和SAA1 (血淀粉酶A) 的水平升高(Figure 4B-4D), 而APOC4 和PF4 (血小板因子) 水平降低(Figure 4B-4D)。HDL依赖的胆固醇外流能力与ApoA2水平 (r=0.68, P=0.04; Figure 4E)相关，还与APOC4水平成负相关 (r=0.65, P=0.04; Figure IIIA在线补充), 这与胆固醇向外周导向能力的增加包括升高的ApoA2是一致的。尽管在急性应答过程中SAA1 和SAA2蛋白水平是升高的(Figure 4D)，但是胆固醇外流能力与这两个蛋白并不相关（Figure IIIB and IIIC，在线数据补充）。总之，这些数据表明，沉默miR-144导致HDL颗粒的产生，这进一步促进了胆固醇从细胞中导向外周，这可能是在体内导致胆固醇导向外周能力增加的一个重要发现 (Figure 3)。
图4.沉默miR-144重塑了HDL颗粒
4.新的miR-144调控的通路识别
为了进一步了解miR-144的分子靶点，研究者对小鼠的肝脏组织进行了基因表达分析(Figure 5A)。差异表达基因的通路分析发现了诱导和抑制的通路(Figure 5B)。其中，高度诱导的基因是Cyp7b1 (Figure 5A)。RT-PCR、WB实验也证实了miR-144依赖性诱导的Cyp7b1 mRNA (Figure 5C)和CYP7B1蛋白在anti–miR-144处理的肝脏中升高(Figure 5D)。为了验证Cyp7b1 是否是miR-144的直接靶点，研究者克隆了荧光素酶报告基因的3′UTR 下游。MiR-144能够以浓度依赖性的特点减少荧光素酶的活性，说明Cyp7b1就是miR-144的直接靶点 (Figure 5E)。
CYP7B1/氧化固醇7α-羟化酶将27-羟基胆固醇代谢成7α,27-去羟基胆固醇, 而27-羟基胆固醇可能加剧了动脉粥样硬化的进程。研究者假设anti–miR-144处理的小鼠肝细胞中CYP7B1 酶活性的升高将导致粥样硬化前体物质27-羟基胆固醇水平的下降。与其假设相一致的是，研究者证明了与PBS或者anti–miR对照组比较，anti–miR-144处理后血浆中27-羟基胆固醇水平下降了34%(Figure 5F)。这些变化是对27-羟基胆固醇特异性的，因为其它胆固醇并未因anti–miR-144处理而发生变化 (Figure 5F和FigureIVA在线补充数据)。巨噬细胞也表达Cyp7b1，因此，研究者分析了anti–miR-144处理的小鼠主动脉中Cyp7b1 mRNA的水平。结果发现Cyp7b1在anti–miR-144处理的小鼠主动脉组织中显著升高 (Figure 5G), 说明anti–miR-144可能在巨噬细胞中的局部效应导致了 27-羟基胆固醇水平的下降 (Figure 5F)。肝细胞CYP7B1在胆汁酸的生物合成通路中也发挥一定的作用。但是，anti–miR-144 处理的小鼠在总胆汁酸水平上无显著变化 (FigureIVB在线数据补充)。总之，这些数据表明，沉默miR-144使Cyp7b1 mRNA表达增加CYP7B1活性的升高,从而降低了粥样硬化前体物质27-羟基胆固醇水平。
图5.miR-144在动脉粥样硬化中调控的新通路的识别
5.拮抗miR-144以一种性别双相性的方式改变了胆固醇代谢从而防止了动脉粥样硬化的发生
已知Cyp7b1在雄性和雌性小鼠中差异性表达，那么研究者便探索了miR-144对Cyp7b1的调控是否具有性别特异性。先前的研究已经证明肝细胞Cyp7b1的表达与雌性相比，在雄性小鼠中2-3倍式的升高， Cyp7b1的缺失导致27-羟基胆固醇水平的升高,这也说明了 27-羟基胆固醇的产生在雄性和雌性小鼠中也具有差异性。事实上，对性别之间的体细胞组织的基因表达的综合分析发现，细胞色素酶P450在小鼠肝脏中是具有性别双相性的基因家族，对100种遗传独特性的近交系品系的小鼠肝脏的分析说明Cyp7b1在雄性小鼠的肝脏中是显著上调的基因，而非雌性(Figure VC 在线数据补充)。
一般认为，性别特异性对于疾病来说会产生特殊的效应，比如由于雌性存在雌激素的保护作用，通常是保护性的效应。为了确定miR-144和动脉粥样硬化之间潜在的性别差异，研究者通过西方饮食16周的喂养模式建立了Ldlr-/-动脉粥样硬化小鼠模型。在图2中, 一组小鼠在16周后安乐死(基线), 剩下的小鼠转为饲料喂养以减弱动脉粥样硬化的进一步发展，接下来分别以生理盐水、anti-miR对照, 或 anti–miR-144处理4周。结果发现，miR-144 的基线水平在雌性中比雄性高50%，这说明，miR-144在雄性和雌性中本身就具有差异性 (Figure 6A)。在雌性小鼠中沉默miR-144 后发现miR-144下降了75%，而在雄性小鼠中为80%，但是miR-144的残差值在雌性中是2倍升高(0.37 versus 0.19; Figure 6A)。惊奇的是，anti–miR-144处理后雌性小鼠的动脉粥样硬化病变负荷未见显著变化 (Figure 6B)，其HDL水平升高了13% (Figure 6C), 而在雄性小鼠却升高了15%(Figure 2D), 总胆固醇水平未见变化 (Figure VA 在线数据补充)。
由于研究者观察到血浆中HDL水平的升高，但动脉粥样硬化面积未发生变化，因此研究者在雌性Ldlr−/−中重复了体内RCT分析 (和在图2中的处理相同，即安慰剂[PBS], anti-miR对照组, or anti–miR-144处理)。在雌性小鼠中，研究者发现沉默miR144后RCT至血浆中的升高了20%（Figure 6D),肝脏中33%（Figure 6E), 粪便中31%（Figure 6F)。 而这些变化在雄性小鼠中分别是30%, 80%, 和50%。此外，当分析anti–miR-144处理后的雌性小鼠的肝脏时发现ABCA1蛋白水平在雌性升高了20% (Figure 6G)，而在雄性小鼠中却是50%（Figure 2C vs 20% Figure 6G)。这些数据说明RCT外流水平的降低可能导致了在雌性小鼠中anti–miR-144处理后粥样硬化面积变化不明显。与先前研究相吻合，与雌性相比，雄性PBS处理的肝细胞Cyp7b1表达呈3倍升高(Figure 6H). 经anti–miR-144处理后的肝细胞和主动脉中，雄性小鼠的Cyp7b1 mRNA 表达升高，而在雌性小鼠中未见变化(Figure 6H和Figure VD在线数据补充). 不仅Cyp7b1 表达未见变化，血浆27-羟基胆固醇水平 (Figure 6I), 其它胆固醇(Figure VB 在线数据补充), 或者胆汁酸水平(Figure VE在线)都未见变化。为了确定是否沉默miR-144后，也调控了其它性别双相性表达的肝细胞基因。研究者叠加了雄性和雌性中miR-144差异性表达的基因(Figure 5)与所有性别双相性基因(Figure VC在线)。结果发现有几个性别双相性基因受到沉默miR-144后的差异性调控 (包括 Elovl3 和 Slco1a1; Figure VC在线), 说明miR-144在雄性和雌性中调控的方式不同，而且调控的靶点也不同。 为了确证动脉粥样硬化中Cyp7b1的这些区别是否也在人类病患中可以观察到，研究者从慕尼黑血管生物资料库中的男性和女性病人行颈动脉内膜剥除术中收集了稳定和破裂斑块。与图2K中的人类斑块的数据相一致，miR-144的表达在男性和女性稳定斑块中显著下降(Figure 6J and 6K)。CYP7B1 水平在男性病人中的稳定斑块中升高（Figure 6L), 而非女性病人(Figure 6M), 说明CYP7B1水平在人类斑块成分和稳定性中起着重要的作用。这些数据结合在动物实验中的数据，说明miR-144 在调控胆固醇外流和氧化固醇通路中的性别差异可以解释雄性和雌性小鼠中沉默miR-144后观察到的动脉粥样硬化的不同效应。
图6.沉默miR-144不能防止雌性小鼠的动脉粥样硬化
讨论
在这篇研究中，研究者证实了沉默miR-144在Ldlr−/−的雄性小鼠中抑制了动脉粥样硬化的进展，促进了粥样硬化的退化。当前的研究使用miR-144拮抗剂主要集中在体外Huh7, J774和THP-1细胞中的胆固醇外流研究，在体内的研究目前尚欠缺。 研究者首次证实沉默miR-144增加了体内RCT，导致粪便中3H-胆固醇增加了50%。这些数据与胡等人的研究相一致，即使用激动剂过表达miR-144后，在Apoe−/−的小鼠中RCT减少。此外，研究也发现Abcb11/Bsep和Cyp7a1在肝脏中表达的显著变化，这与体内胆汁酸分泌和胆固醇分泌增加是一致的。总之，这些数据说明沉默miR-144增加RCT的一个机制是胆固醇通过RCT通路向粪便中的排泄增加。研究也首次报道了anti–miR-144处理对于血浆HDL的特性和成分具有显著效应。通过蛋白组学分析, 研究在anti–miR-144处理的小鼠提取的HDL中识别出大量差异性调控的蛋白质。 在显著调控的蛋白中，只有 Saa1和Saa2 mRNA水平受到anti–miR-144处理的显著诱导。尽管血浆中SAA1和SAA2水平的升高与增加的炎症有关， 但HDL颗粒包括SAA1和SAA2在循环中被迅速清除，这说明，anti–miR-144处理的小鼠 HDL可能优先被肝脏清除，这也可以部分解释在anti–miR-144处理的小鼠中RCT增加的原因。APOA2在anti-miR-144的小鼠HDL颗粒中升高，而APOA1水平未见变化。APOA1的保护效应良好建立。但是，APOA2的效应却无法解释，并且存在争议性的报道，有些组报道包含APOA2的HDL颗粒的胆固醇外流能力下降以及粥样硬化的增加，而在其它组中，报道包含APOA2的HDL颗粒事实上是小的颗粒，却具有更好的胆固醇外流能力。总之，对于体内和体外HDL蛋白成分和胆固醇外流的研究数据说明miR-144沉默提高了RCT的一个机制是产生的HDL 颗粒更有利于胆固醇外流，而且倾向于从循环中快速清除。
研究也显示拮抗miR-144促进了雄性小鼠粥样硬化的退化，而非雌性小鼠。沉默miR-144对于雌性Ldlr−/−小鼠粥样硬化的病变并没有效果。anti–miR-144处理使雌性小鼠中miR-144下降了75% ，而在雄性中下降了80%。在雌性小鼠对照组中miR-144的水平是雄性小鼠肝脏中的1.3倍高， 在miR-144沉默后是2倍高的残差。miR-144沉默在雌性小鼠中导致ABCA1蛋白水平升高了20%，而在雄性小鼠中升高了50%。 这种对ABCA1调控的差异可能是由于雌性小鼠miR-144的升高，ABCA1的小幅升高转换成RCT外流至血浆的小幅升高 (雌性20% ，雄性30%), 肝脏(雌性33% ，雄性50%), 粪便 (雌性31%，雄性80%)。为了了解沉默miR-144后的基因变化，研究者进行全基因组分析发现沉默miR-144后导致肝细胞表达基因的显著变化 (总共152种差异调控的基因), 还有在其它组织中的基因变化，比如主动脉壁（FiguresII和V在线补充)，这些变化是沉默miR-144的直接或者间接效应。一种已知的miR可以靶向上百种基因的表达（miR-144预测到有1400种靶基因），70%的mRNAs的3'UTR端都存在至少一个miR结合位点。据报道，至少有4种miR在多种种类和细胞类型中调控ABCA1，其中包括miR-144。每种miR调控ABCA1的特殊贡献是由miR和ABCA1本身在不同组织中的丰度决定的。此外，研究者以及其它作者证明miR-144受到不同刺激在不同细胞环境下的调控，这对微调基因表达的调控更进一步。与Abca1相似, Cyp7b1的3′UTR也很大，也可能受到广泛转录后的调控。事实上，Cyp7b1 3′UTR包含的结合位点有miR-33, miR-758和miR-26,以及能够调控Abca1和脂质代谢的miRs。miR-144对Abca1和或Cyp7b1的调控也可能受到与某个特殊miR在已知3′UTR内的结合位点数目的影响，其它 miR-144靶点的相对表达可以竞争miR的结合位点。这也可能会通过竞争内源性RNAs、转录本而复杂化。因此，还需要深入研究是否存在其它可能机制也会导致anti–miR-144 处理后动脉粥样硬化的减少。此外，在雄性和雌性小鼠中观察到的动脉粥样硬化的保护效应以及在人类斑块中的数据说明沉默miR-144在人类动脉粥样硬化的治疗中具有潜在治疗价值。总之，本研究证实了靶向miR-144的反义寡核苷酸可能使心血管疾病患者中RCT和氧化胆固醇的代谢增加。
研究亮点
1. 动脉粥样硬化是发展中国家的主要死亡原因；
2. MicroRNAs是基因表达的微调器，在动脉粥样硬化的病理生理中具有重要作用；
3. 研究者证明了沉默microRNA-144降低了雄性小鼠的动脉粥样硬化面积，但并非雌性；
4. 氧化固醇代谢酶CYP7B1 (细胞色素p450酶7b1) 是microRNA-144在雄性小鼠内调控的靶基因，但非雌性小鼠；
5. 研究数据证明靶向microRNA-144可能导致心血管疾病患者胆固醇逆向转运和氧化固醇代谢的增强。
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