科研 | 国人作品：转录组揭示中草药提取的新成分牡荆素VB1可抑制黑色素瘤细胞的生长

编译：刘宁，编辑：十九、江舜尧。

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导读

黑色素瘤是一种恶性肿瘤，在全世界范围内发病率逐渐增加，但是对传统化疗和放疗具有耐药性。因此，迫切需要开发低毒性的新型药物来治疗黑色素瘤患者。黄荆是一种芳香灌木，在亚洲国家中广泛分布，也是一种重要的中药材，用于治疗各种疾病。其提取物EVn-50具有广泛的抗肿瘤活性，对结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌和乳腺癌效果显著。牡荆素Vitexin成分1（VB1）是EVn-50混合物中最丰富的牡荆素化合物，可以通过抑制AKT/FOXO3途径来抑制肝细胞癌生长和血管生成，通过抑制mTOR信号传导来抑制绒毛膜癌的生长，但是尚无关于VB1对黑色素瘤的影响的分子机制研究。在这项研究中，研究人员通过各种黑色素瘤细胞系和移植瘤小鼠模型证明VB1在体内和体外对黑色素瘤均具有抑制作用，阻止G2/M期的细胞周期诱导细胞凋亡。通过转录组分析发现这种作用是通过VB1可以影响多种黑色素瘤细胞系中的各种途径，包括p53，凋亡和细胞周期途径。VB1显着诱导ROS的积累从而导致DNA损伤。有趣的是，VB1也可以诱导对BRAF制剂维罗非尼耐药的黑色素瘤细胞中的ROS，导致DNA细胞毒性，从而导致G2/M期停滞和细胞凋亡。以上结果表明VB1可能是一种具有前景的药物用于治疗黑色素瘤。

论文ID

原名：Vitexin compound 1, a novel extraction from a Chinese herb, suppresses melanoma cell growth through DNA damage by increasing ROS levels
译名：从一种中草药提取物的新成分牡荆素成分1通过增加ROS的水平造成的DNA损伤抑制黑色素瘤细胞的生长
期刊：Journal of Experimental & Clinical Cancer Research
IF：5.646（二区）
发表时间：2018年11月6日
通讯作者：张江林、陈香、彭聪
通讯作者单位：中南大学湘雅医院
DOI号：https://doi.org/10.1186/s13046-018-0897-x

实验设计

本文以人类恶性黑色素瘤细胞系A375，Sk-Mel-5、Sk-Mel-28和对BRAF抑制剂维罗非尼耐药的A375细胞系作为实验材料。首先通过CCK-8（细胞计数试剂盒）和克隆形成分析法检测了VB1（牡荆素成分1）对各种细胞系的细胞活力的影响；然后通过流式细胞仪分析了细胞凋亡和细胞周期，并通过免疫印迹验证了细胞凋亡情况。进而在移植瘤小鼠中评估了VB1的体内作用，并通过转录组探索了VB1抗肿瘤的潜在作用机制，并通过实时定量PCR验证了关键的差异表达基因。最后，通过流式细胞仪检测细胞内活性氧（ROS）水平，并通过免疫荧光技术和免疫印迹法检测了DNA损伤情况。

结果

1 VB1抑制黑色素瘤细胞的增殖

试验通过CCK-8分析了VB1对多种黑色素瘤细胞系中细胞活力的影响。如图1b，1c所示，VB1以剂量和时间依赖性方式抑制细胞活力。VB1对A375、SK-MEL-28和SK-MEL-5的IC50值分别为5 μM，15 μM和12 μM（图1c）。为了进一步评估VB1的抑制功效，用VB1处理了黑色素瘤细胞系24小时，然后评估了平板中细胞克隆的形成和生长。结果表明，VB1以剂量依赖的方式抑制了克隆的形成（图1d）。此外，为了确定VB1在正常细胞中的细胞毒性，试验使用更高剂量的VB1处理非致瘤小鼠皮肤表皮细胞系（JB6）和人永生化表皮细胞系（HaCat），结果表明，VB1对两种细胞系的IC50值均超过80μM（图1e），远大于其在黑色素瘤细胞中的有效浓度。这些结果表明，VB1对黑色素瘤细胞具有选择性。
 
图1: VB1抑制黑色素瘤细胞的增殖。
（a）VB1的化学结构；
(b) CCK-8测试细胞活力；
(c) A375和Sk-Mel-28中VB1的IC50值；
(d)将A375和Sk-Mel-28细胞接种到6孔板中，然后按照指示用各种剂量的VB1处理24小时，通过结晶紫染色评估和定量克隆数量；
(e)通过CCK-8测定法确定非致瘤性HaCaT和JB6细胞用VB1处理不同的时间和剂量的细胞活力。
2 VB1诱导黑色素瘤细胞凋亡和G2/M细胞周期停滞

为了阐明VB1如何诱导黑色素瘤细胞毒性，试验分析了A375、Sk-Mel-28和Sk-Mel-5细胞的凋亡和细胞周期，发现VB1可以以剂量依赖的方式显著诱导细胞凋亡和细胞周期停滞在G2/M期。在5μM的低剂量下，VB1分别诱导A375、Sk-Mel-28和Sk-Mel-5的17.48％、16.47％和17.03％发生凋亡。在20 μM剂量下，凋亡率分别增加至39.6％，32.4％和39.1％（图2a）。此外，5 μM VB1可引起G2/M期停滞的细胞周期分布发生变化，而20μ M VB1通过减小G0/G1期的分布显著诱导G2/M期停滞（图2b）。接下来试验检查了VB1治疗过程中凋亡标记基因的表达。结果表明，VB1诱导了BAX的表达上调，BCL2的表达下调（图2c）。为了检查VB1对体内癌细胞生长的影响，对移植瘤裸鼠进行研究，如图2d所示，结果与体外结果一致；VB1完全减缓了移植黑色素瘤细胞的生长，小鼠的体重没有明显变化（图2）。
 
图2 VB1处理诱导黑色素瘤细胞凋亡和细胞周期停滞。
 
3 VB1对基因表达谱和关键途径改变的影响
为了进一步研究VB1抗肿瘤作用机制，研究者利用转录组分析了VB1处理不同黑色素瘤细胞系。结果显示，在VB1处理24小时后，409个基因上调，而102个基因下调，48小时后，2538个基因上调，而3950个基因下调（图3a）。Sk-Mel-5细胞中观察到相似的结果。差异表达基因涉及多种途径，例如JAK-STAT、FOXO、TNF和细胞周期相关途径（图3b）。其中p53、DNA损伤和细胞周期有关的关键途径与VB1诱导不同黑素瘤细胞系停滞在G2/M期的影响一致。接下来，研究者通过Q-RT-PCR验证了关键的差异表达基因，结果与RNA-seq结果一致（图3c）。
 
图3：转录组分析VB1对基因表达的影响。
（a） 将A375细胞用10μM VB1处理48小时。
（b）KEGG途径用于分析与差异表达基因相关的途径。气泡图中显示了排名前20位的正富集途径。x轴是富集得分，y轴是富集途径。
（c-d）c和d图是RT-Q-PCR分析VB1处理的A375（c）和Sk-Mel-28（d），数据表示为平均值（n = 4）±S.D.。星号（*）表示显著性差异（p <0.05）。
4 VB1通过增加黑色素瘤细胞的细胞内ROS诱导DNA损伤

研究者推测VB1对细胞的作用可能是通过诱导DNA毒性产生的。结果表明VB1处理以剂量依赖性方式显著增加p53、P-ATM、P-ATR、P-CHK2和γH2AX表达。总ATM，ATR和CHK2蛋白水平的表达没有明显变化（图3a）。此外，在细胞核中观察到了γH2AX的积累（图3b、3c），表明DNA损伤。进一步检测小鼠肿瘤组织中Ki67、P53和γH2AX的表达，发现VB1处理后P53和γH2AX表达显著增加，并且Ki67的表达受到抑制，这与VB1抑制黑色素瘤细胞生长的结果一致（图2d）。VB1处理显著提高了不同黑色素瘤细胞系的细胞内ROS水平（图3d），抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）可以部分降低ROS的升高（图4e）。综上所述，VB1促进了细胞ROS的积累并导致黑色素瘤细胞DNA损伤。
图4 VB1通过增加ROS诱导DNA损伤
6 VB1可以降低耐维罗非尼的黑色素瘤细胞的生长

BRAF抑制剂靶向药物维罗非尼在用于晚期黑色素瘤患者的治疗时会出现耐药性。因此，研究者探究了VB1对维罗非尼耐药细胞的影响。通过低剂量诱导获得“耐药”细胞系（标记为RA）。通过对细胞生长、细胞周期、细胞凋亡、转录组分析基因表达以及ROS等，结果与对维罗非尼敏感的细胞相同，VB1促进细胞内ROS的积累，从而导致非耐维罗非尼的黑色素瘤细胞和耐药性黑色素瘤细胞中DNA损伤，细胞周期G2/M期停滞和细胞凋亡，表明VB1可能用于治疗耐维罗非尼的黑色素瘤。

讨论

在这项研究中，VB1在体外（图1b和1d）和体内（图2d）显著阻断了包括A375、Sk-Mel-28和Sk-Mel-5在内的各种黑色素瘤细胞系的细胞生长。同时VB1对肿瘤细胞具有选择性，非肿瘤细胞的IC50值远大于其黑色素瘤细胞的有效浓度（图1c和1e），这与先前的对小鼠的血清检测结果一致。VB1可导致细胞凋亡并导致细胞周期G2/M期的停滞（图2a，b）。此外，VB1处理后导致Bax的表达增加、BCL2的表达降低（图2c），这表明VB1诱导黑色素瘤细胞凋亡。
利用转录组分析了VB1对细胞信号通路的影响。VB1处理后，p53途径、细胞周期途径和凋亡途径被显著改变。在mRNA水平上验证了细胞周期细胞凋亡和DNA损伤的关键基因的表达，其中明显上调的基因包括诱导细胞周期停滞的P21、调控调节DNA核苷酸切除修复的GADD45、诱导细胞内ROS和DNA损伤的PUMA。因此，这些差异表达的基因为VB1处理如何诱导黑素瘤细胞G2/M期停滞提供分子机制。
P53是重要的DNA损伤反应组件，在肿瘤发生中起关键作用，研究表明诱导P53表达可以显著抑制黑色素瘤细胞的生长。本研究结果表明，VB1处理后DNA损伤相关蛋白包括P-ATM，P-ATR，P-CHK2和γH2AX以及P53及其下游P21显著增加（图3a），表明VB1通过DNA损伤抑制黑色素瘤细胞生长，最终导致P53途径相关的细胞周期停滞和细胞凋亡。
活性氧（ROS）在某种程度上促进了癌症的发展，但是ROS的积累达到了阈值会导致细胞死亡。因此，增加ROS水平以诱导癌细胞死亡是众所周知的抗癌策略。例如白藜芦醇等植物药用化合物都是通过诱导细胞内ROS导致DNA毒性诱导凋亡的。在本研究中，VB1可以显着增加ROS的水平，DNA损伤的指示物γH2AXVB1处理后γH2AX在细胞核中的表达呈时间依赖性，说明VB1通过增加细胞内ROS引起DNA损伤、G2/M周期停滞和细胞凋亡。
服用BRAF抑制剂超过6个月会出现致命的耐药性或转移复发。本研究发现VB1还可以显着抑制耐BRAF抑制剂维罗非尼的细胞生长。诱导耐药细胞IC50值与其亲代细胞相似（约3-5μM），且作用机制也相同，这表明VB1可以完全克服黑素瘤的BRAF抑制剂耐药性。

结论

综上所述，本研究证明VB1促进细胞内ROS的积累，导致黑色素瘤细胞和BRAF抑制剂耐药性黑色素瘤细胞中的DNA损伤，造成G2/M细胞周期停滞和细胞凋亡，这为VB1用于抗黑色素瘤的治疗提供了证据（图5）。
 
图5 VB1的作用机理 

评论

皮肤黑色素瘤是最具侵袭性的恶性肿瘤之一，容易对传统化疗和放疗产生耐药性，因此迫切需要开发用于黑色素瘤的新药物。从传统中草药中筛选抗癌有效成分是开发新型药最佳途径。本研究探讨了中药黄荆中具有抗癌中药的有效成分VB1对黑色素瘤细胞的作用，通过对体外各种黑色素瘤细胞系以及体内移植瘤小鼠模型评估了VB1的作用并初步研究了VB1的作用机制，结果表明VB1对黑色素瘤具有很好的选择抑制作用，通过转录组等分析发现抑制作用是通过诱导了细胞ROS积累导致DNA损伤来实现的。同时研究特别针对黑色素瘤耐药性严重的问题，发现VB1对BRAF抑制剂耐药的黑色素瘤细胞系具有相同的作用。研究揭示了中草药有效成分VB1作为抗黑色素瘤药物的潜力及作用机制，为抗癌中药的深入挖掘和研究奠定了基础。
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