科研 | Cell Stem Cell：青春期睾丸发育动态转录细胞图谱
编译：不二，编辑：十九、江舜尧。
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人体睾丸在青春期会经历剧烈的发育和结构变化，包括体细胞生态细胞的增殖和成熟以及精子发生。为了研究这个过程，研究者测序分析了四个青春期男孩的约10000个睾丸细胞的单细胞转录组，并将其与婴儿和成人的睾丸细胞进行了比较。在青春期期间，未分化的精原细胞在配子发生开始之前发育并分化。鉴定了常见青春期前期的睾丸间质和肌样细胞的祖细胞，并解析了控制青春期分化的候选因子。此外，青春期前期的支持细胞表现出两种不同的转录状态，在青春期汇合到另一个单独的成熟细胞群体之前，代谢谱有所不同。通过对睾丸素抑制的变性人的单细胞分析，进一步强调了睾丸素在睾丸支持细胞成熟、抗菌肽分泌和精原细胞分化中的作用。综上所述，关于人类睾丸发育的转录图谱提供了有关发育变化和男性青春期的关键因子的多种见解。
论文ID
原名：The DynamicTranscriptional Cell Atlas of Testis Development during Human Puberty
译名：青春期睾丸发育动态转录细胞图谱
期刊：Cell Stem Cell
IF：21.464
发表时间：2020.1
通讯作者：Bradley R.Cairns
通讯作者单位：美国犹他大学医学院亨斯迈癌症研究所
DOI号：10.1016/j.stem.2019.12.005
实验设计
本研究以人类睾丸组织作为实验材料，捐赠者分别来自4名7、11、13和14岁的青少年男孩，以及2名26岁和50岁的变性人。对所有样本进行组织学HE染色确认后，制备单细胞悬液，使用10x Genomics平台进行了单细胞测序。测序数据经过质控和过滤后比对到人类参考基因组，并进行生物信息学分析。结果使用免疫荧光（IF）和免疫组织化学（IHC）实验进行验证。
结果
人类少年睾丸的单细胞转录组
通过快速尸检程序收集了4名7、11、13和14岁的青少年捐献者的整个睾丸（图1A），Johnsen评分分别为3、4、4和7。与年龄一致，组织学检查显示了该时间轴上睾丸形态和组成的变化（图1B）。在7岁的样本中，观察到睾丸小索缺乏明显的层或腔，形成类似于胎儿或出生后早期小鼠睾丸的结构。在11岁的样本中，管状的结构逐渐变得明显，而在13岁和14岁样本的小管中观察到清晰的层和腔（图1B）。为了表征这种发育进程的分子特征，从这些睾丸组织中分离了单细胞，并使用10x Genomics平台进行了scRNA-seq。对于每个捐赠者，进行了两个单独的技术重复，产生了8个数据集。在总共10000个单细胞中，有7675个通过了标准质控（QC）和过滤，用于下游分析。在每个细胞中获得了约200K的reads，以及约1500-2000个基因。测序饱和率为85％，技术重复相似性高（r>0.95）。
为了研究青春期发育并与其他时间点进行比较，研究者将青少年数据集与之前发表的成人和婴儿数据集相结合，总共产生了13797个单细胞（经过QC过滤后）。首先使用Seurat软件对数据进行tSNE分析（图1C），生成了八个主要细胞簇，随后使用已知的标记基因进行注释（图1D）。细胞簇1-3是生殖细胞，C1代表精原细胞（UTF1+，FGFR3+），C2代表精母细胞（SYCP3+），C3代表减数分裂后的精细胞（PRM3+）。细胞簇4-8分别是支持细胞（C4；SOX9+）、睾丸间质和肌样细胞（C5；IGF1+和/或ACTA2+）、平滑肌细胞（C6；NOTCH3+）、巨噬细胞（C7；CD14+）和内皮细胞（C8；VWF+）。
图1 人类少年睾丸的单细胞转录组分析
青春期精原细胞增殖和分化的不同阶段
通过分析生殖细胞，检查了青春期生殖细胞组成的变化，并对初始细胞簇1-3进行特定聚类（图2A）。关键标记基因的表达模式和与之前工作的比较将生殖细胞分为四个发育阶段：缓慢自我更新和未分化的精原细胞（状态0-1），其标记基因状态为UTF1+和MKI67-，以KIT+和MKI67+为标记基因分化的精原细胞（状态2-4）（注：状态4是准备进入减数分裂状态且缺乏MKI67表达），精母细胞（STRA8+和GPR85+）和精细胞（PRM3+）（图2A和2B）。使用Monocle软件的正交伪时间分析进一步支持了细胞时间轨迹（图2C和2D）。生殖细胞在青春期不同阶段的相对组成如图所示（图2D和2E）。1岁和7岁儿童的生殖细胞仅由未分化的精原细胞（对应于状态0-1）组成（图2A，2D和2E），它们表达UTF1和其他早期生殖干细胞标记基因（图2B）。在11岁的样本中，虽然大部分细胞仍处于0-1未分化的精原细胞状态，但分化的精原细胞和减数分裂细胞也开始出现（图2D和2E）。在婴儿和7岁的样本中，精原细胞相对较少（约占总睾丸细胞的3％-4％），而在11岁及以上的样本中，精原细胞的相对比例显著增加，占总睾丸细胞的约10％-15％，与精原细胞扩增和分化前的增殖期一致。13岁的样本与11岁的样本非常相似（可能反映了已知的青春期起始的年龄差异），尽管后减数分裂细胞的比例增加。最后，在14岁的样本中，生殖细胞的组成与成人相似，表明进入精子发生状态（图2E）。
使用免疫荧光（IF）来验证scRNA-seq的结果（图2F和2G）。首先，观察了所有年龄段的UTF1+未分化的精原细胞（状态0-1）。增殖和分化的精原细胞（状态2-3）显示出多种增殖标记基因的上升（例如，细胞周期蛋白，CDK，TOP2A，MKI67，KIT），而MKI67+精原细胞仅在11岁以后才变得明显起来，并且仅在14岁之后发现显著表达的减数分裂标记基因SYCP3。对UTF1和KIT的共染色显示，在青少年发育过程中KIT+精原细胞的逐渐稳定增长（图2F和2G），表明精原细胞正在逐步分化。总之，转录组和蛋白质数据与免疫组化（IHC）研究相结合，指示了婴儿期和青春期之间的三个独立的阶段：（1）未分化的精原细胞处于静止或缓慢自我更新的阶段；（2）精原细胞增殖（有丝分裂）的短暂时期，具有有限的和不完全的精原细胞分化，发生在青春期初期；（3）建立稳定和平衡的精原细胞自我更新和分化，并进入完全配子发生状态。
图2 人类青春期精原细胞增殖和分化的不同阶段
支持细胞成熟过程中的基因表达动态
研究了青春期支持细胞的发育。在青春期前期的样本（7岁）中，UTF1和SOX9的染色显示了由混合的精原细胞和支持细胞组成的索状结构（图3A）。青春期开始时（例如11岁和13岁的样本），支持细胞和精原细胞在小管的基底膜上对齐，并形成腔，这种模式在14岁的样本中进一步发展（图3A）。为了表征这种形态上的重新组织，解析并检查了支持细胞群体（图1C中的细胞簇4）。研究者注意到，成熟的支持细胞比10x Genomics系统中捕获的要大，这可能解释了老年支持细胞的比例较低。因此，尽管获得了足够的细胞数量来研究支持细胞的转录特征，但这阻止了对发育过程中支持细胞总数变化的定量。聚类分析鉴定了两个较大的支持细胞簇，其两侧是两个较小的细胞簇（图3B和3C）。细胞周期分析显示较大的右侧细胞簇（图3B和3C）包含所有少年样品的细胞，并偏向于G1期。而左侧细胞簇则主要由较年轻样本的细胞组成（1-7岁），并处于不同的细胞周期。Monocle伪时间分析还将1岁和7岁的支持细胞划分为两个不同的状态，分别是未成熟#1和#2（图3D和3E）。这两个状态合并为一条导致成熟支持细胞的途径，并从11岁起开始在样品中出现（图3D和3E）。
观察到未成熟#1细胞和成熟的支持细胞的多种特征，可以将它们与未成熟#2细胞区分开来，包括高AR（雄激素受体）靶基因表达（由一组约70个已知的AR依赖基因定义）、高线粒体基因表达和较低的核糖体蛋白基因表达（图3F）。基因本体论（GO）分析显示，未成熟#1细胞中的核和转录功能的富集。IF的AR和SOX9的共染色证实了这一结果，青春期进行时支持细胞中的AR逐渐上调和SOX9共定位（图3H）。未成熟#2细胞具有未成熟#1细胞的相反特性，并且富集于翻译和核糖体功能的GO特征。它们表现出较高的核糖体蛋白基因、线粒体ATPases（例如ATP5E）和线粒体膜蛋白（例如TOMM7）的转录水平，并且在细胞周期的G1期包含更高比例的细胞（图3F）。总之，这两个未成熟的支持细胞状态在它们的代谢/线粒体、翻译和细胞周期特性上明显不同。
通过伪时间和差异基因表达进行支持细胞成熟分析表明，约有1000个基因在未成熟阶段和成熟阶段之间的动态表达存在差异。如预期的那样，在支持细胞成熟期间与细胞骨架、细胞形态发生和细胞外基质相关的基因上调。在青春期期间，编码抗菌天然免疫肽的基因（包括防御素类肽）和免疫相关基因（例如ISG15）也上调（图3F，3G），支持细胞保护睾丸免受感染，尤其是在性成熟后。为了证实这一点，进行了IF/IHC染色，并观察到青春期未成熟的支持细胞标记基因AMH的下调（图3J），以及14岁样品中支持细胞中免疫肽LGALS3和S100A6的上调（图3I）。未成熟#1细胞标记基因PDPN的免疫染色（图3F）显示，11岁的睾丸中的空间分离，表明不同小管中支持细胞的成熟是异步的，并逐渐进行。综上所述，研究数据描述了青春期后支持细胞状态的复杂发育过程，涉及形态发生、代谢和先天免疫。
图3 青春期前期睾丸中两个支持细胞状态的鉴定
常见睾丸间质和管周肌样细胞的祖细胞
聚类分析最初将睾丸间质和肌样细胞分配在一个大的细胞簇中（C5；图1C）。进一步对C5的聚类分析显示，来自11岁和更年轻样本的细胞大量重叠，并在小鼠中共享胎儿睾丸间质和肌样前体细胞已知标记基因的表达（例如MAFB和NR4A1；图4A和4B），以及与成熟睾丸间质和肌样细胞相关的标记基因的异质共表达（例如DLK1和ACTAA2）。但是，在从13岁到成年的样本中，观察到睾丸间质（DLK1和IGF1标记基因）和肌样细胞（ACTAA2和MYH11标记基因）明显分离。Monocle伪时间分析显示，青春期前期（1-7岁）的细胞紧密聚集在一起，随着青春期的进行，轨迹分叉成两个细胞簇（图4C和4D）。因此，两种计算分析模型都提出了一个共同的表达模式，并定义了青春期之前睾丸间质和肌样细胞的双能祖细胞。
研究者鉴定了细胞谱系特异性基因，产生了约1000个差异表达的基因（图4E）。早期前体表达与转录相关的特定基因（例如MAFB和NR4A1）；随着细胞向肌样细胞谱系发育，与细胞骨架和细胞粘附相关的基因开始表达，与形成其独特的小管周围结构的肌样细胞一致。相反，沿着睾丸间质细胞谱系前进的细胞表达参与分泌的基因，与这些细胞的已知类固醇生成功能一致。IF染色显示，在7岁和11岁的样本中，管和层中的ACTA2和MYH11信号较低或缺失，从13岁开始后，管周围呈层状环状结构（图4F和4G）。同样，CYP11A1的表达（睾丸间质细胞类固醇生成的标记基因）随着青春期的进行而逐渐出现（图4H）。
图4 睾丸间质和周围肌样细胞的常见祖细胞
使用其他少年睾丸样本进行正交验证
为了进一步验证结果，对另外五个婴儿青少年样本（1、2、4、11和14岁）进行了IHC实验。与上述结果一致，研究者观察到青春期AR表达逐渐上调，同时随着支持细胞的成熟，AMH逐渐下调。此外，在这些独立的样品中，CYP11A1的表达仅在14岁的样品中明显，表明成年睾丸间质细胞的完全成熟。同样，肌样细胞标记基因ACTA2仅在青春期后期（14岁）显示清晰的层状表达。这些染色结果为本研究的基因组学发现的普遍性以及4个分析的睾丸样品的验证提供了进一步的确认。
青春期睾丸发育的信号通路
为了探索青春期生殖细胞生态及生态间的相互作用，研究了信号转导因子的关系。研究者观察到了来自多种信号通路的编码配体、抑制因子、受体和基因靶标的基因动态和细胞类型特异性表达，包括视黄酸（RA）、激活素/抑制素、NOTCH、GDNF、FGF和WNT。这些结果与已报道在人类或小鼠中的已知关系一致，并提供了其他有关青春期时间和分子关系。例如，由于7至11岁的样本中不存在STRA8表达，RA不太可能参与人类青春期从未分化的精原细胞向分化的精原细胞的转变。此外，实验数据支持激活素和BMP信号通路是青春期候选关键通路：发现支持细胞成熟时INHA下调，而睾丸间质细胞在青春期后期表达高水平的INHBA，导致青春期后期激活素增加和抑制素活性降低。IHC染色证实，随着青春期的进行，INHA蛋白下调。有趣的是，激活素受体（ACVR1B、BMPR1B和ACVR2B）在精原细胞中表达，而激活素信号转导的关键抑制因子（FST、BAMBI和NOG）在未分化的精原细胞中特异性表达（状态0和1）。因此，激活素信号通路在缓慢的自我更新和未分化的精原细胞中似乎被选择性抑制，但在增殖和分化的精原细胞中具有活性，所以有必要进一步探索精原细胞分化过程中的功能作用。
睾丸素（T）抑制的变性人的睾丸单细胞分析
尽管先前的数据和目前的分析均表明，AR和睾丸素（T）在青春期促进睾丸发育（精原细胞和生态细胞）中起着关键作用，但具体的分子机制尚不清楚。因此，为了更好地研究T在成人睾丸中的功能，研究者检查了两名长期接受T减少的成年变性人的睾丸表达谱。其中一个睾丸（Tf1）来自受T抑制的50岁的变性人，在确认性别的手术取出睾丸之前先用螺内酯（T拮抗剂）和雌二醇治疗19个月。另一个睾丸（Tf2）来自一名26岁的变性人，在确定性别的手术取出睾丸之前，用螺内酯和雌二醇治疗了16个月。在这两种情况下，组织学检查均显示成年未治疗的睾丸和T抑制的睾丸之间的主要区别：总体来看，T抑制的睾丸的小管结构被破坏，生殖细胞发育受到极大损害（图5A）。对两个T抑制的睾丸分离的单细胞进行scRNA-seq。对于Tf1，两个技术重复非常相似，产生2161个单细胞（QC过滤后）。对于Tf2，其中一个重复细胞数量是Tf1的两倍以上。对于Tf1和Tf2，tSNE和聚类分析揭示了由聚类和关键标记基因注释定义的主要睾丸细胞类型（图5B和5C）。但是，研究者注意到，两个样本中细胞类型的相对比例差异很大。因此，将需要进行检查和控制参数（例如患者年龄，治疗时间等）更大范围的研究来解释所有差异。但是，该分析揭示了在变性人样本和重复样本之间的一系列的一致发现。例如，研究人员观察到低比例（在Tf1中）或不存在（在Tf2中）分化的精原细胞（例如KIT+）、精母细胞或精细胞，而在两个变性人样本中，与未经治疗的样品相比，表达未分化标记基因（例如UTF1+）的精原细胞明显存在（图5B-5E；图6C），其比例相对丰富。与scRNA-seq结果一致，在T抑制和未治疗的睾丸中均观察到UTF1蛋白表达，而T抑制的精原细胞中MKI67和SYCP3信号均显著降低（图5D）。对支持细胞标记基因SOX9的染色揭示了T抑制的睾丸中扭曲的定位模式（图5E），深入的研究可以更好地了解T抑制作用如何影响支持细胞。
图5 睾丸素（T）抑制的变性人的睾丸单细胞转录组分析
睾丸素（T）促进体内生殖细胞和支持细胞的发育
为了更好地了解睾丸素（T）抑制对睾丸细胞发育的影响，结合两个T抑制的变性人和所有6个未经治疗的男性（从婴儿期到青春期到成年）的scRNA-seq结果，并进行了分析（图6A和6B）。Tf1和Tf2的精原细胞与未经治疗的精原细胞聚集在一起（图6B），这表明它们并未转变为新状态，而是以未经治疗的男性中的状态存在。T抑制的睾丸到未经治疗的睾丸的精原细胞状态的关键标记基因显示，在T抑制的睾丸中未分化的精原细胞（状态0和1）的比例更高（图6C）。进一步的tSNE和精原细胞的聚类分析表明，细胞聚类是基于“状态”而不是“供体来源”（图6D和6E）。两项分析的结果进一步表明，T抑制的睾丸未分化的精原细胞可分为状态0和状态1的细胞。首先，观察到状态0和状态1细胞簇的清晰分离（图6D和6E）；第二，未经治疗或T抑制的睾丸的状态0或1细胞表达相似水平的特异性标记基因（图6F）。总之，这些结果表明，T对状态0-1精原细胞的转录谱影响有限，尽管其抑制作用会损害其分化进程。
此外，科研人员对支持细胞进行了组合分析，发现来自两个T抑制的睾丸的支持细胞与11岁至13岁的样本比14岁或成年的样本更相似（图6G）。早期支持标记基因（包括AMH和HES1）的上调以及后期支持细胞标记基因（包括免疫相关基因S100A6，ISG15）的下调进一步支持了这一点。因此，成人中的T抑制可能导致支持细胞发育状态的部分逆转，模仿了青春期的各个阶段。
图6 睾丸素促进体内支持细胞和生殖细胞的发育
讨论
男性青春期涉及睾丸重量和生理的重大变化，包括生态细胞发育以建立生精小管、精原细胞分化和激素信号传导调节，最终建立稳定的精子发生。为了在分子和全基因组水平上更好地理解这一复杂过程，本研究在单细胞水平上首次获得了青春期转录细胞图谱，提供了与多种分析模式的基础数据资源。为了进一步促进数据访问和可视化，研究者设计了一个网站，可以浏览和查询感兴趣基因的表达模式（https://humantestisatlas.shinyapps.io/humantestisatlas1/）。
关于生殖细胞的发育，成年人类睾丸的数据集确定了5个细胞的精原细胞状态（状态0–4），并提供了证据表明状态0和1对应于未分化的储备生殖细胞。值得注意的是，观察到精原细胞的比例（相对于总睾丸细胞）大幅增加（从7岁的样本中的3％增加到11岁的样本中的约13％）。已报道的IHC研究中A型精原细胞相对数量也有类似的增加，两者共同提示了一个增殖期，包括状态0-1精原细胞的扩张，伴随着生精小管的重组和发育。值得注意的是，本研究的scRNA-seq和蛋白质验证不能解释以前报道的两个组织学上不同的细胞种群Adark和Apale精原细胞。实验结果与最近发表的工作一致，未在激光捕获显微解剖的Adark和Apale精原细胞中发现明显的转录差异，这表明需要更多的蛋白质组学和功能性实验来解释可能的差异。值得注意的是，小管形态发生（具有确定的基底层和腔）与分化的精原细胞的首次出现（状态2-4）一致，而配子生成没有完成，因为观察到的精子很少。因此，精子扩张阶段（涉及状态0-1）和初始分化阶段（涉及状态2-4）处于完成精子发生的能力之前。此外，从青少年和变性人的睾丸中得出的结果表明，状态0和1确实是储备的（未分化、静止或缓慢更新）精原细胞，即使在没有T或T抑制的情况下，也在婴儿期到成年期中都存在。T抑制的睾丸，虽然精子发生受到严重损害，但观察到的精原细胞群体的转录谱与未经治疗的成人睾丸中的状态0-1细胞群体相同。这可能解释了当停止T抑制后，某些变性人的精原细胞恢复配子发生的能力。
虽然AR敲除或T抑制的啮齿动物仅在减数分裂时或之后才显示出生殖细胞发育受阻，但数据将T的上调与分化的精原细胞的出现相关联，并在精子发生中起作用。在猕猴中，用GnRH抑制剂治疗2周可降低T并损害未分化或自我更新（Adark细胞）的精原细胞的发育，但不会改变Adark精原细胞的比例，表明在猕猴和人类中精原细胞的分化都可能需要T。这种作用是否由拥有T受体（AR）的支持细胞介导，或T是否通过直接调节AR信号通路的精原细胞仍然未知。最后，尽管观察到了T的作用，但信号通路分析表明，其他配体（例如激活素，NOTCH等）可能会控制人的精原细胞分化。
小鼠和人类出生后的睾丸生理显著不同。青春期前期的男性显示出睾丸小索，缺乏明显的层或腔，其结构类似于胎儿或出生后早期小鼠睾丸的结构，并且在青春期前期逐渐获得了更多的管状结构。关于精原细胞在这些小索和新生小管中的位置，与先前的工作一致，在青春期前期样本的基底膜和小索/小管内均观察到精原细胞，并且青春期前后及随后的阶段与基底膜完全对齐。因此，数据和分析以及其他已报道的工作表明，从1岁到青春期前期，人类精原细胞的发育和生理在人类与小鼠之间是非常不同的。
关于体细胞发育，研究展现了一些见解。首先，精原细胞和生态细胞的转录特征在1岁和7岁的样本之间几乎没有变化，但是之后阶段发生了巨大变化。例如，观察到处于婴儿期至少年期两个不同的支持细胞群体，它们在代谢、线粒体和细胞周期特性方面有所不同，但在转录和染色质因子方面缺少重大变化，表明这些状态可能不是不同的发育状态，而是可变的生理状态。出乎意料的是，这些状态在青春期似乎融合为一个成熟的支持细胞群体。在这里，PDPN在11岁的睾丸中一个小管子集中表达，表明支持细胞成熟是一个异步和渐进的过程。未来的研究应侧重于支持细胞状态之间的生理、代谢和功能差异，以及免疫肽的作用和对T的调节作用。最后，数据表明抗细菌/病毒肽可能对保护青春期后与性活动有关的感染起到重要作用。
重要的是，本研究鉴定了人类睾丸间质和肌样细胞的常见前体，该前体表达（低水平和异质性）与成熟睾丸间质和肌样细胞相关的标记基因。还鉴定了小鼠中已知的某些因子存在于胎儿体细胞前体（例如MAFB）中，但是在本研究鉴定的人类阶段中未观察到NESTIN（小鼠胎儿睾丸间质细胞前体的已知标记基因）。这些人类睾丸间质或肌样前体从婴儿期一直持续到青春期，然后随着生精小管的发育而分化和成熟。因此本研究结果揭示了小鼠和人类之间关于体细胞发育的标记基因和它们出现的时间的主要差异。研究者还注意到，T抑制的睾丸间质和肌样细胞显示出改变的转录组，这些转录组不仅仅是发育上的退化模式，还促使人们进一步研究T对维持睾丸间质和肌样细胞功能的影响。此外，人与小鼠之间发育时间的差异可能解释了小管周围肌样细胞组成的差异（人是多层的，而小鼠是单层的），这可以在非人灵长类动物模型中进一步探讨这些差异。
关于局限性，目前的研究概述并分析了人类青春期的四个睾丸样本。鉴于人类存在青春期起始的年龄差异，并且青春期是一个渐进的过程，因此未来研究加上其他样本可能会揭示有关发育过程和过渡的更多细节。同样，两个变性人之间观察到的差异，还需要进行其他研究以了解观察到的变异的起源。此外，本押金分析和解释主要集中在初始蛋白质验证研究支持的转录数据上，并且存在转录后机制将补充和完善对分子策略以及少年睾丸不同细胞成分之间复杂相互作用的理解。
评论
人类睾丸是出生后研究大部分细胞类型、生理和功能的少数器官之一。该研究在研究人类睾丸发育的策略和时机方面提供了重大进展。在青春期前期，睾丸在未成熟的生态中维持着一群未分化且大部分处于静止状态的生殖干细胞。在青春期早期，生态细胞的成熟首先发生，涉及常见祖细胞的分化以形成成熟的睾丸间质细胞和小管周围的肌样细胞，这有助于生精小管的层腔结构形成，从而促进信号通路以及下丘脑-垂体-性腺轴激素传导。同样，支持细胞群体会发育并改变其定位，以及它们的转录、代谢和信号传导特征。然后未分化的精原细胞的增殖开始逐渐填充伸长的小管，然后进行精原细胞分化和第一个减数分裂细胞的生成，最终稳定地产生精细胞和成熟精子。研究数据进一步强调了精子发生的建立需要多个信号通路之间复杂的相互作用。这些结果可在灵长类动物模型中做进一步探索，并将支持人类生精小管和精原细胞成熟的体外培养的发展和改善，最终帮助指导男性不育症的治疗提供选择。
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