慢病毒构建稳转细胞系实验流程

慢病毒（Lentivirus）是一种逆转录病毒，为双链RNA。不同于一般的病毒，慢病毒具有更广泛的宿主，对正在分裂的细胞和非分裂的细胞均具有感染能力。重组慢病毒载体是以HIV-1为基础，使用疱疹病毒VSVG 外壳蛋白发展起来的工具载体，其毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。慢病毒可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而可以在宿主细胞中持久性表达。
目前实验使用的病毒主要为慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒。
慢病毒与其他病毒比较，具有以下优势：
1安全性高：由于慢病毒剔除毒性基因，目前实验未发现致病性，已被用于CAR-T治疗于人体；
2 表达时间长：慢病毒通过将外源基因整合到宿主细胞基因组上，可实现目的基因长时间稳定的表达，不随着细胞分裂传代而丢失，是细胞实验的首选；
3 免疫原性低： 直接注射活体组织不易造成免疫反应，适用于动物实验。
 
实验流程：
1 慢病毒包装：公司使用3质粒慢病毒包装系统，慢病毒系统使用pLKO.1-EGFP、psPAX2、pMD2.G，过表达慢病毒系统使用pLVX-AcGFP、psPAX2、pMD2.G三质粒系统，将质粒混匀后使用磷酸钙转染方法瞬时转染至HEK293T细胞中，轻轻混匀后放入培养箱中培养48h后，收集上清。使用genecopoeia公司慢病毒颗粒纯化试剂盒将慢病毒纯化。纯化后留取部分检测病毒滴度，其余病毒冻存于-80℃冰箱中。
2 滴度检测：将病毒颗粒使用梯度稀释，分别感染293T细胞，感染72h后，在荧光显微镜下观察细胞荧光表达情况。根据细胞荧光量计算病毒滴度。
3 细胞感染：在病毒感染前一天对细胞进行计数，接种约10000个细胞于12孔板中，培养过夜后使用无血清培养基稀释病毒，加入12孔板中对细胞进行感染，病毒数量根据推荐细胞的感染MOI加入（若无推荐MOI，需做病毒梯度：1,5,10,50,100 5个梯度对细胞感染），感染6h后去除含病毒溶液，加入完全培养基细胞培养，培养48h后，在荧光显微镜下观察细胞荧光强度。同时加入puromycin对细胞筛选，筛选约2周时间。细胞筛选好后，使用定量PCR和Western blot检测目的基因的稳定表达情况。

结果示例：

图 病毒感染后细胞荧光示例图
A MOI检测，不同浓度病毒对细胞感染后，荧光表达变化。B 2种贴壁细胞病毒感染后荧光表达情况