科研│SCI IMMUNOL：COVID-19和流感的免疫表型凸显I型干扰素在重症COVID-19发展中的作用
编译：刘娟，编辑：景行、江舜尧。
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大多数感染急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）的患者会出现轻症新型冠状病毒肺炎(COVID-19)，部分患者会出现重症COVID-19并伴有急性呼吸窘迫综合征和全身炎症反应。为了明确驱动COVID-19严重感染进展的因素，本文采用健康捐赠者，轻、重症COVID-19患者和重症流感患者的外周血单核细胞(PBMCs)开展单细胞RNA测序。COVID-19患者PBMCs中的所有细胞均表现出高炎症反应特征,尤其是与重症流感患者组相比，TNF/IL-1β驱动的炎症反应更明显。在重症COVID-19患者的经典型单核细胞中,I型干扰素(IFN)反应与TNF/IL-1β共同驱动炎症反应，而在轻症COVID-19患者中未见此现象。本文还记录重症流感患者I型干扰素驱动的炎症反应特征，在此基础上，提出I型干扰素反应在重症COVID-19炎症加重过程中发挥关键作用。
论文ID
原名：Immunophenotyping of COVID-19 and influenza highlights the role of type I interferons in development of severe COVID-19
译名：COVID-19和流感的免疫表型凸显I型干扰素在重症COVID-19发展中的作用
期刊：Science Immunology
IF：13.44
发表时间：2020年7月
通讯作者：Jun Yong Choi; Sung-Han Kim; Inkyung Jung; Eui-Cheol Shin
通讯作者单位：Korea Advanced Institute of Science and Technology; Yonsei University College of Medicine
DOI号：10.1126/sciimmunol.abd1554
实验设计
结果
1 COVID-19患者和流感患者PBMCs的单细胞转录组
收集健康捐赠者(n = 4)、重症流感住院患者(n = 5)和不同临床严重程度(包括重度、轻度和无症状)COVID-19患者的PBMCs(n = 8)。8例COVID-19患者之中选择3例(C3、C6和C7患者)，在其住院期间不同时间点分两次收集PBMCs。将COVID-19患者的PBMCs标本按照全血取样当天评估的国家预警评分(NEWS;轻度< 5，重度≥5)分为重症或轻症COVID-19组。在NEWS评分中，评估呼吸频率、氧饱和度、氧补充量、体温、收缩压、心率和意识。不考虑NEWS评分，将需要住院治疗的患者定义为重症流感患者。重症流感患者是2015年12月至2016年4月COVID-19出现前被收治的。重症COVID-19组在采血当日淋巴细胞计数明显低于轻症COVID-19组，而其血清C反应蛋白水平明显高于轻症COVID-19组。对SARS-CoV-2的N基因、RdRP基因和E基因进行多重实时聚合酶链反应(PCR)检测，3个基因的Ct值在两组间无统计学差异。
利用10×Genomics scRNA-seq平台，对所有患者的59,572个细胞进行严格的高质量筛选，平均每个细胞获得6900个独特的分子识别器(UMIs)，平均每个细胞检测到1900个基因。生物复制(同一组的PBMC标本)的转录组谱具有高重复性，保证本研究生成scRNA-seq数据的高质量。
为了检验细胞类型特异性的宿主免疫应答，研究者使用Seurat包对59,572个细胞进行基于高度可变基因的t分布领域嵌入算法(tSNE)，并通过患者或实验批的scRNA-seq识别出22个不同的无偏倚簇(图1A)。根据已知的标记基因和两个未分类的clusters，这些clusters被划分为13种不同的细胞类型(图1B和C)。在下游的分析中,只关注11个不同的免疫细胞类型,包括免疫球蛋白G−(IgG－B)细胞,IgG+B细胞,记忆效应(EM)样CD4+T细胞,非EM样CD4+T细胞,EM样CD8+T细胞,非EM样CD8+T细胞、自然杀伤(NK)细胞,经典型单核细胞、中间型单核细胞,非经典型单核细胞,树突状细胞(DC)，排除血小板,红细胞(红血球)和两个未分类的clusters。编号为C8的无症状病例也因缺乏复制基因而被排除在外。在层次聚类中，大多数来自同一细胞类型的转录组谱倾向于聚集在一起，其次是疾病组，这表明免疫细胞类型和疾病生物学是可变免疫转录组的主要驱动因素。
研究疾病组与健康捐献者组的PBMCs中免疫细胞的相对比例作为免疫改变的特征(图1D和E)。流感和重症COVID-19与轻症COVID-19的变化不同，他们PBMCs中的多种细胞均观察到显著变化。在重症COVID-19患者中，经典型单核细胞比例显著升高，而树突状细胞、非典型单核细胞、中间单核细胞、自然杀伤细胞、EM样CD8+T细胞、EN样CD4+T细胞比例显著降低(图1E)。在重症流感中，经典型单核细胞的比例显著升高，而树突状细胞、非EM样CD4+T细胞、EM样CD4+T细胞、IgG+B细胞和IgG－B细胞的比例显著降低。通过流式细胞术分析验证scRNA-seq的免疫细胞亚群的比例。scRNA-seq检测的淋巴细胞总数、B细胞总数、CD4+T细胞总数、CD8+T细胞总数、自然杀伤细胞总数和单核细胞总数的相对比例与流式细胞术检测结果相关。
图1. COVID-19和流感患者PBMCs的单细胞转录组。(A)59572个PBMCs来自健康捐献者(HDs,4个样本，17590个细胞)，重症流感患者( FLU,5个样本，10519个细胞)，COVID-19患者(无症状：1个样本，4425个细胞，轻症COVID-19：4个样本，16742个细胞，重症COVID-19：6个样本，10296个细胞)。(B)已知标记基因标准化表达的tSNE图。(C)以注释单元格类型着色的tSNE图。(D)排除未分类1、未分类2、红细胞、血小板的各组细胞类型比例。颜色表示细胞类型信息。(E)盒式图显示轻症COVID-19(n=4)、重症COVID-19(n=6)、FLU(n=5)患者与HDs(轻症COVID-19对比HDs：n=16，重症COVID-19对比HDs：n=24，FLU对比HDs：n=20)相对细胞类型比例。方框图表示四分位距(IQR)，whiskers分别对应1.5×IQR内的最高点和最低点。排除未分型1 (每细胞UMIs相对较高且存在多个标记基因)、未分型2 ( B细胞样及核糖体蛋白基因高表达)、RBC、血小板。对疾病组和健康对照组各细胞类型进行双侧KS检验，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
2 与COVID-19相关的转录特征
为了比较疾病间感染的影响，研究者对健康捐赠者组的相对基因表达变化进行了层次聚类。出乎意料的是，PBMCs中所有类型的细胞都是按照疾病组聚在一起，而不是按照细胞类型聚在一起（图2A）。基于K-means聚类的进一步研究支持PBMCs中所有类型细胞中COVID-19特异性基因表达升高或下降的模式。这些结果表明，在COVID-19中，无论细胞类型如何，外周血免疫细胞都可能受到常见炎症介质的影响。尽管COVID-19和流感有不同的转录特征，但重症COVID-19和流感在所有类型的单核细胞和树突状细胞(图2A，黑箱区)中都有相同的转录特征，这反映重症流感和重症COVID-19先天免疫反应可能具有共同机制。
接下来，研究者试图根据GO生物学途径来识别疾病特异性上调或下调基因的相关生物学功能。首先，将轻症和重症COVID-19合并为COVID-19组，并使用模型单细胞转录组(MAST)分析，与健康捐献者组做对比，确定每种细胞类型的基因特异性变化。NFKB1、NFKB2、IRF1和CXCR3在COVID-19中特异性表达水平升高，CXCL10、STAT1、TLR4和HLA II类基因和免疫蛋白酶体亚基在流感中特异性表达水平升高，而TNF、TGFB1、IL1B和IFNG在两种疾病中表达水平都升高。当直接比较COVID-19和流感时，NFKB1、NFKB2和TNF在COVID-19中表达水平升高，而STAT1、TLR4和免疫蛋白的亚基基因在流感中表达水平升高。对于每组差异表达基因(DEGs)，鉴定出富集程度最高的10条GO生物通路，并将其收集起来以验证P值在每组DEGs中的富集(图2B)。炎症反应基因在COVID-19和流感中均高度活跃，但转录因子基因，包括炎症因子(即NFKB1/2和STAT4)在COVID-19中表达水平升高。相比之下，与流感相比，COVID-19中与IFN-I和IFN-II信号通路、T细胞受体通路和适应性免疫应答相关的基因反应很少。这种疾病特异基因表达模式在单细胞分辨上表现为GBP1(IFN-介导的信号通路)在流感中特异性表达升高,CREM(转录正调控)在COVID-19中特异性表达升高， CCL3(炎症反应)普遍表达升高(图2C)。
研究者对收集到的与图2B相关的基因进行连接加权基因相关网络分析(WGCNA)，按细胞类型特异性的方式展开。发现几个模式化的表达模式(图2D)：在COVID-19组中，NFKB1/2、JUN和TNF在CD8+T细胞和NK细胞中模式化(图2D中的G6和G7)，IL1B、NFKBID和OSM在所有类型的单核细胞和树突状细胞中模式化(图2D中的G3)；在流感组中，GBP1、TAP1、STAT1、IFITM3、OAS1、IRF3和IFNG在所有类型的T细胞和NK细胞中均被模式化(图2D中为G2)，CXCL10和TLR4在所有类型的单核细胞和树突状细胞中均模式化(图2D中为G5和部分G6)。
3 CD8+T细胞在COVID-19和流感中的不同亚群
为了揭示CD8+T细胞的疾病特异性转录特征，研究使用Seurat对EM样和非EM样CD8+T细胞簇进行了亚聚类分析。与其他两组相比，各疾病组特异性富集的亚簇均被鉴定为非EM样CD8+T细胞簇 (图3A)。在非EM样CD8+T细胞簇的6个亚簇中，cluster 1和cluster 3分别在流感组和COVID-19组中显著富集。在随后的分析中，排除血小板标记物PPBP高表达的聚类。cluster 1和cluster 3的上调基因分别与先前定义的“甲型流感病毒感染”和“SARS-CoV感染”基因集相关。本文还发现cluster 3特异性上调的基因包括CD27、RGS1、CCL5、SELL和RGS10，表明免疫反应已激活。基于STRING v11对每个cluster中选择的前30个上调基因进行蛋白互作网络分析，发现cluster1中PRF1、GNLY、GZMB和GZMH表达水平升高，cluster 3中GZMK、GZMA、CXCR3和CCL5表达水平升高(图3D, 绿色)。IFN-γ优先上调的基因STAT1、TAP1、PSMB9和PSME2仅在流感特异性cluster 1中过表达(图3D,蓝色)。通过对细胞内染色granzyme B和 phorbol2-myristate 13-acetate(PMA)/ionomycin刺激的细胞内细胞因子染色来验证这些数据。CD8+T细胞中granzyme B+和IFN-γ+之间的细胞比例显著高于COVID-19组。在促炎和IFN反应的7条代表性的GO生物学通路中,IFN-I和IFN-II的反应通路更多地与流感特异性cluster 1相关,而TNF或IL-1β的反应通路在COVID-19 特异性cluster 3中更为突出(图3E)。
图3. CD8+T细胞亚群分析。(A)所有分组(左，n=6253)、COVID-19(右上，n=2653)、流感(右中，n=1452)和健康对照组(右下，n=2148)非EM样CD8+T细胞亚群的tSNE图。(B和C)箱线图显示各组内非EM样CD8+T细胞簇的子簇比例(COVID-19，n=10，FLU，n=5，HD，n=4)。除COVID-19组中cluster 3所占比例外，其余比例均符合Shapiro-Willk检验的正态分布(P=0.04)。cluster 1和cluster 3分别在FLU和COVID-19组中高度富集。双侧t分布检验P值分别为cluster 1中COVID-19与流感组间4.4×10-3，cluster 1中流感与健康对照组间3.5×10-2，cluster 3中COVID-19与流感组间8.6×10-3，cluster 3中COVID-19与健康对照组间5.8×10-3。*P<0.05，**P<0.01。(D)对cluster 1(左)和cluster 3 (右)的前30个上调基因进行STRING分析。(E)柱状图显示8条具有代表性促炎和IFN的GO生物通路富集P值在cluster 1或cluster 3特异上调基因(cluster 1，n=66，cluster 3，n=183)。
4 COVID-19中经典型单核细胞的转录特征
研究者对所有三种类型的单核细胞聚类进行了亚聚类分析以寻找COVID-19特异性的亚聚类，没有发现COVID-19特异性富集的亚群。接下来，进一步探究经典型单核细胞在炎症反应中的关键作用。研究流感和COVID-19之间的差异基因，以寻找COVID-19在经典型单核细胞中的特异性转录特征(图4A)。TNF和IL-1β是炎症反应中的主要基因，分别被鉴定为COVID-19特异性的上调基因。为了更好地描述典型单核细胞的转录特征，本文用至少一个疾病组中与健康捐献者组做对比，对上调基因进行了K-means聚类。最终确定五种不同的上调cluster(图4B):cluster 1中基因在所有疾病组中普遍表达升高,cluster 2是流感特异性,cluster 3与轻症/重症COVID-19相关，cluster 4与流感和重症COVID-19相关,cluster 5具有重症COVID-19特异性。
研究者使用来自于每个细胞因子处理细胞的细胞因子应答基因集(LINCS L1000配体per-富营养化扰动分析)，通过基因集富集分析(GSEA)检测每个cluster特异性基因。COVID-19特异性cluster 3基因被TNF/IL-1β应答基因富集,而流感特异性 cluster 2基因除了TNF/IL-1β应答基因外,还被IFN-I应答基因富集(图4C),表明与COVID-19相比，IFN-I反应在流感中占主导地位。本文通过分析其他来源的具有细胞因子基因集的cluster特异性基因证实了这一结果(图4D)。但除TNF / IL-1β反应基因外，cluster 4和cluster 5还与IFN-Ⅰ应答基因有很强的相关性(图4E)，表明重症COVID-19除了具有TNF / IL-1β的炎症反应特征外，还具有IFN-Ⅰ反应特征。
5 重症COVID-19中IFN-I反应和TNF／IL-1β炎症反应
本文直接比较轻症和重症COVID-19的经典型单核细胞，分析DEGs时，发现重症COVID-19的特征是多种ISGs表达水平升高，包括ISG15、IFITM1/2/3和ISG20(图5A)。TNF/IL-1β应答基因和IFN-I应答基因均富集于重症COVID-19特异性基因 (图5B)。本文测定较大分组COVID-19患者血浆TNF，IL-1β，IL-6,IFN-β，IFN-γ和IL-18的浓度，在这些细胞因子中，IL-6和IL-18在重症COVID-19组较轻症COVID-19组浓度明显升高，而其他细胞因子在血浆中的浓度在两组之间无差异。这些结果表明，由于细胞因子的重叠性，细胞因子应答基因信号不能简单地用几个细胞因子来解释。
为了进一步研究重症COVID-19的特征，本文选取两个内部控制良好的标本(一个重度和一个中度，两个PBMC样本均来自同一COVID-19患者C7)，使用Monocle 2进行了轨迹分析。轨迹分析将经典型单核细胞按病情严重程度分别与cluster 1和cluster 3和早期拟时pseudotime对齐(图5C)。cluster 1的代表基因在重症COVID-19中富集，与IFN-I和TNF/IL-1β相关炎症反应高度相关 (图5D)。GSEA证实IFN-I反应和TNF/ IL-1β炎症反应均在cluster 1,而在cluster 3中不显著 (图5E)。与cluster 3相比，cluster 1与系统性红斑狼疮(具有IFN-I特征的典型炎症性疾病)的基因集相关性显著(图5F，左)，但与类风湿关节炎的基因集相关性不显著(图5F，右)。
通过分析对IFN-I不敏感但与TNF诱导的TLR刺激耐受相关的基因模块，本文获得重症COVID-19中IFN-I介导的TNF炎症反应的额外证据。Park等人此前证实，尽管TNF本身是一种炎性细胞因子，但TNF可耐受TLR诱导的单核细胞基因表达。他们还表明,IFN-I通过减弱TNF的耐受作用引起高炎症反应，并将IFN-I介导 TNF-NF-kB炎症反应的基因模块定义为“1级”。该基因模块在cluster 1中显著富集，而在cluster 3中未富集(图5G)，这提示IFN-I反应可能通过消除负反馈机制而加重高炎症反应。
6 验证COVID-19致死病例中尸检肺组织的高炎症特征与IFN-I反应
最后，研究者使用COVID-19致死病例尸检肺组织的大量RNA-seq数据来验证IFN-I反应和炎症特征。虽然该分析仅局限于两名患者，没有单细胞类型分辨率，但在基因组浏览中发现COVID-19致死患者尸检肺组织和重症COVID-19的经典型单核细胞中普遍存在IFITM1、ISG15和JAK3表达水平升高和RPS18表达水平降低(图6A)。在与细胞因子反应性基因子集的分析中,肺组织IFN-I反应和TNF／IL-1β炎症反应均显著(图6B)。肺组织中的DEGs与cluster 4和cluster 5显著相关，cluster 4在流感和重症COVID-19中普遍被上调，图4B中的cluster 5具有重症COVID-19特异性(图6C)。这些基因也与轨迹分析中发现的cluster 1显著相关，但与cluster3不相关(图6D)。当基因子集被轻症和重症COVID-19之间的DEGs定义时，尸检肺组织的DEGs与重症COVID-19特异性上调的基因显著相关(图6E)。
图6. 验证COVID-19致死患者尸检肺组织转录组IFN-I和炎症反应。（A）UCSC Genome Browser代表性基因图。(B)柱状图显示利用L1000 LINCS中4细胞系的扰动基因对尸检肺组织上调基因(n=386)进行富集分析，柱状图显示平均-log10(P值)值。(C)尸检肺组织中GSEA显著上调和下调的基因来源于图4B中C2(n=96)、C3(n=143)、C4(n=218)和C5(n=30)上调的基因。(D和E)从图5C(D)的轨迹分析可以看出，基因组尸检肺组织中显著上调和下调基因的GSEA来源于cluster 3 (左)和cluster 1 (右)中的前200个上调基因，基因组来源于轻症(左)和重症(右)COVID-19(E)的经典单核细胞中前200个上调基因。
讨论
研究证明重症COVID-19是由高炎症反应引起的。特别是，经典型单核细胞和巨噬细胞分泌的炎性细胞因子在COVID-19严重程度进展中发挥关键作用。本文和之前的研究都表明TNF/IL-1β的炎症反应在COVID-19中占主导地位。本文还发现重症COVID-19除了TNF/IL-1β反应外，还伴有IFN-I 反应。这些结果表明，在COVID-19严重程度进展中，IFN-Ⅰ反应可能通过增强TNF/IL-1β驱动的炎症来参与高炎症反应。
本文采用PBMCs来开展scRNA-seq，而不是感染部位的标本（如肺组织或支气管肺泡灌洗液）。健康捐献者组相对变化的层次聚类显示，PBMCs中所有类型细胞按疾病分组聚在一起（图2A），表明PBMCs中所有细胞都存在疾病特异性。这一发现表明，无论细胞类型如何，外周血免疫细胞都受到常见炎症介质的影响。然而，目前研究使用的是PBMCs而不是全血样本进行scRNA-seq，因此无法检测粒细胞。
在细胞因子反应的转录组研究中，研究者经常分析细胞因子反应基因，而不是细胞因子基因本身。由于细胞因子的重叠性，无法从上调基因列表中精确地确定相关的细胞因子。例如, TNF／IL-1β或其他细胞因子驱动NF-kB调控基因的表达水平升高，IFN-Ⅰ或其他IFNs驱动IFN应答基因的表达水平升高。本文聚焦在IFN-Ⅰ反应，因为许多上调IFN-反应基因都是典型的ISGs。
最近，Wilk等人使用COVID-19患者和健康对照者的PBMCs进行scRNA-seq。与本文类似，他们在COVID-19患者的单核细胞中发现了IFN-Ⅰ驱动的炎症特征。然而，他们在COVID-19患者的外周血单核细胞中未发现促炎细胞因子基因如TNF、IL6、IL1B、CCL3、CCL4和CXCL2的大量表达，而本研究检测到TNF、IL1B、CCL3、CCL4和CXCL2的表达升高。此外，他们在COVID-19患者中发现了本研究没有发现的发展期中性粒细胞种群。这些不同结果可能是由不同平台的scRNA-seq所致。Wilk等人使用Seq-Well平台，而本文使用更普遍的10×Genomics平台。即使对COVID-19的scRNA-seq分析的平台相同，有时也会得出互不相关或相互矛盾的结论。这种情况经常发生在对高多维数据的无监督分析中，因此设计COVID-19的scRNA-seq分析时，需要更加谨慎，包括定义严重程度和采样时间点。
最近，Blanco-Melo等人研究体外感染细胞、感染的白鼬和COVID-19致死患者尸检肺部样本中SARS-CoV-2的转录反应，并报告称IFN-I和IFN-III反应被减弱。与SARS-CoV-2感染的白鼬相比，COVID-19致死患者尸检肺部样本中IFN-I信号通路和先天免疫应答基因表达相对升高。鉴于SARS-CoV-2在白鼬中只导致轻症疾病而不是重症，我们认为IFN-I反应在重症COVID-19(如COVID-19致死患者尸检肺部样本)中表达水平升高，而在轻症COVID-19(如感染SARS-CoV-2的白鼬)中表达水平不升高。当前研究发现的重症COVID-19特异性显著多于Blanco-Melo等人研究中公开提供的尸检肺组织数据，虽然分析仅限于两名患者且没有单个细胞类型分析。在最近的一项研究中，Zhou等人发现COVID-19患者的肺泡灌洗液中除了促炎症反应外，还有一个强大的IFN-I反应。此外，研究还证实IFN-I应答基因在SARS-CoV-2病毒感染的肠道类器官中表达升高。
IFN-I除抗病毒活性，还具有免疫病理作用，IFN-I反应的有害作用在SARS小鼠模型中得到了很好的证明。在SARS-CoV感染的BALB/c小鼠中，IFN-I反应诱导致病性炎性单核-巨噬细胞聚集和血管渗漏，导致死亡。研究提出在致病性冠状病毒感染期间，IFN-I反应延迟但表达量相当多，关系到急性呼吸窘迫综合征的发展和致命性。
目前，重症COVID-19的发病机制尚不清楚，对重症COVID-19患者的治疗没有明确的方法，主要依赖重症监护和机械通气。本文证明重症COVID-19的特点是TNF/IL-1β驱动的炎症反应结合IFN-I反应。在SARS-CoV病毒感染的小鼠模型中，IFN-I反应的时间是决定感染结果的关键因素，早期IFN-I反应控制病毒复制，而晚期IFN-I反应导致病理性炎症。因此,重症COVID-19患者的治疗方面的抗炎策略不仅需针对TNF/IL-1β和IL-6在内的炎性细胞因子, 还需针对病理性IFN-I反应。
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